细胞世界

这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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请问，我是直接在96孔版做的，没有加抗荧光淬灭剂，发现很快就消失了荧光，我的二抗是PE的。请问你的荧光可以维持多久呢？

PE标记的二抗我没用过，其他荧光二抗我用的比较多，一般我用进口的抗淬灭封片剂封片后荧光片子放在冰箱几个月都不会淬灭，当然，如果本身做出荧光片子在镜下看就很微弱的话就保存的不会太久。之前没用抗荧光淬灭封片剂封片的片子也能保存好一段时间的，一般也不会说2-3天就全淬灭了。

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请问大神~你用的是什么封片剂？直接滴到细胞爬片上然后正面朝下固定在载玻片上面？
放冰箱保存的话是4度么？
然后~如果我直接在24或者96孔板上铺细胞，后续加抗体什么的都直接往里面加，可以往里面加防止猝灭的封片剂么？（之前都是在里面加pbs就算了然后直接拿到镜下去看。拍照的时候都怕没拍完荧光就没了）

细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
......

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前辈，你好。我想问下，如果是已经标记荧光（比如FITC、APC等）的抗体去染细胞膜上的抗原的话怎么做？