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标题:【求助】细胞免疫荧光步骤

newway[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pou 于 2015-9-12 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原 ...

染细胞膜抗原的话就不用破膜，省略掉第3步，既然一抗自带荧光标记，那么第6步也就可以省略了，其余步骤都不变即可。
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pou[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 newway 于 2015-9-12 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

染细胞膜抗原的话就不用破膜，省略掉第3步，既然一抗自带荧光标记，那么第6步也就可以省略了，其余步骤都不变即可。

我再多问几个问题，1.加上正常山羊血清的目的是什么，我没有山羊血清的话这一步可不可以不做？2.后面用PBST洗片，可不可以用PBS代替？
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079777chao[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问培养板和湿盒都要消毒吗?不好意思，问题比较简单，见笑了。

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这个不需要哦，只有细胞培养的时候需要无菌，免疫荧光都不用消毒的
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ldh[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pou 于 2015-9-12 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我再多问几个问题，1.加上正常山羊血清的目的是什么，我没有山羊血清的话这一步可不可以不做？2.后面用PBST洗片，可不可以用PBS代替？

1.封闭非特异性的能与二抗结合的抗体，山羊血清加上后可减轻背景，没有的话可以用1%-5%的BSA(可用PBS，溶解，稀释），还在园子里见到用FBS封闭的，其实主要就是要血清或者蛋白结合非特异位。
2.是可以的，pbst，中是pbs加入TWEEN20,根据实验内容需要。
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我要做免疫荧光双标记，一个在细胞膜，一个在胞内，这个还要Triton透化吗？透化会对膜上的有影响吗？我主要是看胞内蛋白转移到细胞膜与膜上的蛋白结合。请各位大侠指教。
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发表于 2015-9-12 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复楼上战友，我研究的是外源加入的一种蛋白和细胞膜上一种受体蛋白结合，因为不涉及胞质中的成分，我固定之后直接封闭，不做通透（通透可能会破坏膜上受体结构）。
对于你的实验，我觉得可以选择通透，因为通透之后有助于抗体进入胞质中并表达出荧光。之前我做过膜上受体蛋白单标荧光，从荧光照片上看通透之后照的照片依旧很漂亮。（当然对在胞膜上高表达受体蛋白可能影响较小，如果是低表达的膜受体可能影响较大），以上纯属个人见解，仅供参考。
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发表于 2015-9-12 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你们有没有出现过染色体通道很多杂质，刚开始上汞灯时很干净，几分钟后就出现杂质然后越照越亮的情况？其它通道很干净。之前一直都好好的，最近几个月老这样
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气泡[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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前辈。我是把细胞接种到不透光的陶瓷材料，再进行免疫荧光。步骤和上面差不多，为什么啥都看不见呢？
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xyw5[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 气泡 于 2015-9-12 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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前辈。我是把细胞接种到不透光的陶瓷材料，再进行免疫荧光。步骤和上面 ...

细胞能看见吗
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气泡[使用道具]
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发表于 2015-9-12 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 xyw5 于 2015-9-12 15:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

细胞能看见吗

细胞也看不见
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