小中大【求助】opa法测18种氨基酸遇到的问题
我按照A Vasanits文献上的方法测定18种氨基酸
用的opa/mpa方法
柱子是RESTEK 150 mm*4.6 保护柱20mm
solvent A 0。05 M醋酸钠
solvent B 0。1 M 醋酸钠:乙睛：甲醇＝46：44：10
流速 1。8 ml/min （文献先1。1 再2。1）
柱温 30 （文献上温度50）
如果按照该文献上的梯度洗脱程序
time B
0 1
14 9
17 35
20 35
24 45
26 100
29 100
31 0
40 0
我的大部分峰都出峰较晚，并且挤到一起了，而且峰也没有文献上那么窄
于是我改梯度洗脱程序为
time B
0 1
4 1
12 35
27 43
30 100
34 100
35 0
40 0
这样出峰要好不少，但是在24－26 min时有三个峰粘在一起（try，phe，i－leu）， 27－28的峰很宽
大概就是这样的图片点击可在新窗口打开查看
有几个问题想请教一下各位大大
1。我还需要怎样修改梯度洗脱程序？
2。文献上的最佳温度是50，但我发现温度升到40度的时候，峰型就不好看了，我温度需要保持30度么
3。对于solvent B的pH值，我是在加入有机溶剂以前调到7。2，还是加入有机溶剂以后到7。2？（加入有机溶剂以后不调pH值是8。3，乙睛由于制备方法偏碱性）
4。流速上需要做调整么？如果用2。1 ml/min的流速，压强就会超过3000
5。我的峰型比文献上宽，并且有三个峰粘到一起是否是因为柱子柱效不行了还是因为我死体积太大?
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更新：
十分感谢楼下几位色友的回答，目前我做了以下调整：
1。pH值是在加入有机相以前调。
2。更换了一根更长的柱子
3。改mpa为npa
分离度已经得到很大提高，不过捏，还是跟文献上有一些区别
温度是30。c，流速1。8（怕流速太高毁柱子）
还有一点问题就是thr和gly完全分不开，还有就是solventb在达到45％时就已经出峰完全了，我需要降低乙睛的用量而加大甲醇的用量么？
