小中大【求助】两步法PCR--有效提高PCR效率--减少非特异性扩增
在美国学习期间，跟美国导师学的一种方法，效率挺高的，而且可以大大降低非特异性扩增，和大家分享一下，可能很多国内的朋友早就会，别见笑。
引物1：GGGCC GAATTC GACGTGAGTAGATCGACTCC
当我们从基因组上PCR扩增我们的目的片段然后克隆到载体上时，往往这样设计引物，分三部分组成我们的引物，第一部分GGGCC为保护碱基，GAATTC为酶切位点，第三部分GACGTGAGTAGATCGACTCC为根据我们的目的序列设计的。这里将根据第三部分设计的GACGTGAGTAGATCGACTCC可以计算出来一个退火温度（52度），根据整个引物计算的温度为（62度）。
由于保护碱基和酶切位点与基因组没有特异性，所以简单的根据整个引物计算的温度设定退火温度会明显的影响我们的PCR效率和产物的特异性。所以最好采用两步法PCR技术。
常规PCR条件如下：
94度 2min；
94度 30s
52度 30s
72度 1到2min
30个循环
72度 10min
这种方式由于退火温度较低，所以往往有非特性扩增，而且影响聚合酶的效率；
两步法PCR条件：
94度 2min；
94度 30s
52度 30s
72度 1到2min
10个循环
94度 30s
62度 30s
72度 1到2min
再加上20个循环
72度 10min
这种方法，前期的十个循环可以保证特异性引物与基因组DNA特异结合，少量扩增到目的片段（此时得到的片段已经包括了酶切位点和保护碱基），所以可以提高退火温度到62度了，引物也可以照样结合，减少了温度变化大引起的酶活力降低，同时提高退火温度可以降低非特异性扩增。我以前的经验表明，效果非常好，很多扩不出来的目的片段都被我用两步法PCR搞定了，而且基本没出现过低退火温度遇到的非特异性扩增条带。在此也对我美国加州大学洛杉矶分校的美国导师表示感谢。
