小中大我建议,配总管的时候,是加水,mix和cDNA模板。混匀,每孔加好,最后再加引物的,因为20ul体系中经常只需要1ul的模板,如果是最后每个孔每个孔的加,枪头外带一点点,误差就会大。至于要不要加到管底是无所谓的,一离心就会到管底的。还有气泡的问题,我们知道,PCR开始的时候,温度是升高到95度的,这样的高温,气泡都会破的。
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引物加的更少吧,也就0.4ul,比模板要少,按您的说法“最后每个孔每个孔的加,枪头外带一点点,误差就会大”,就算最后加引物是不是也同样存在误差大的问题呢?如果担心枪头外带一点点误差大的话,可以换枪头吧,不过有点浪费。