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标题:[求助]关于realtimePCR条件如何摸索的问题

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发表于 2011-9-18 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是曲线


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发表于 2011-9-18 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一共是从10的6次方-0次方的7个稀释度，只有前四个样品有结果。（SYBR GREEN），样品的copy数必须大于1000？
偶用的是hotsart taq，mg浓度是2.5，是否还需要继续优化？
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发表于 2011-9-18 09:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的这次实验r=0.999,但是slope=-2.116,扩增效率居然是156%，该如何分析，进一步优化？
急盼各位指导！
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发表于 2011-9-18 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一共是从10的6次方-0次方的7个稀释度，只有前四个样品有结果。（SYBR GREEN），样品的copy数必须大于1000？
偶用的是hotsart taq，mg浓度是2.5，是否还需要继续优化？

==============================================================================================================

你现在用了多少个循环？
我做的几个拷贝数都可以出来，看来你还得继续优化镁离子。
你可以现作一个镁离子梯度优化，体系的其他成分不变，镁离子从3.0到5.0，跨度0.5，这样改变的只是镁离子和水的量，5个镁离子浓度，一锅就可以出来。
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发表于 2011-9-18 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用了36个循环
基因250bp，延伸时间1min

那我用多少拷贝的质粒呢？
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发表于 2011-9-18 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得一般情况下只要系统优化好，10的0次方拷贝数完全可以，如果不放心，你可以从10的0次方做到10的5次方或6次方.
是不是可以试一下加到40个cycles。
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发表于 2011-9-18 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实在36循环内，1000copy以下已经有荧光信号，但是从熔解曲线看，明显不是目的基因
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发表于 2011-9-18 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我正在做real-time RT-PCR，对标准品的制备存在一些疑问。我用的是一管两酶法，从理论上讲是不是应该用RNA做标准较为科学？我看大家的贴子中用质粒做标准的很多，有哪些讲究呢？此外我在准备RNA标准品的时候，用的是promega的体外转录试剂盒，可RNA的纯度很低，OD260/OD280经常在1.8或以下，我完全是按照试剂盒的要求做的，不知有哪些地方处理不当。请指教，也请各位战友帮忙提提建议。
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发表于 2011-9-18 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想这里大多数战友都是用的两步法，即在普通PCR上RT，然后用cDNA上realtime PCR。这种情况下通常是用质粒DNA作标准品的。一步法我没有做过，但是我觉得RNA标准品的制备、保存、稳定性这几个方面都不如DNA好控制。关于制备RNA，我更是没有什么经验，希望其他战友提些好的建议。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-18 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于绝对定量,则需要采用标准品,可以使用质粒DNA或者体外转录的RNA,然后通过测定260和280nm的OD值获取浓度,这里需要考虑一些问题:
(1) DNA或者RNA必须是保证纯,不能有污染(RNA或者DNA),否则OD读数不准确
(2)就是实验者的PIPETTING,这是做REAL TIME最重要的问题,必须保证每个稀释浓度的准确
(3)虽然DNA比RNA稳定,但是用于做RNA的定量,还是应该采用RNA做标准品,然后按照同样的PROTOCOL逆转录,否则这里存在的差异可能影响结果的,而这时对于RNA需注意其稳定性,如有兴趣可以参考下文献
Collins ML, Zayati C, Detmer JJ, Daly B, Kolberg JA, Cha TA, Irvine BD, Tucker J, Urdea MS.
Preparation and characterization of RNA standards for use in quantitative branched DNA hybridization assays.
Analytical biochemistry. 1995 Mar 20;226(1):120-9.
links:
cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W9V-45NJ0NT-8X&_coverDate=03%2F31%2F1995&_alid=128248542&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=6692&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=5b2e438af435080494e66a92dfdd7e10')
而目前多数RNA定量依然使用相对定量方法,但是这种方法的前提是TARGET基因和内参照基因的扩增效率必须近似,一般斜率需要在-3.32附近,而两者的差值要在0.1以内
如果用DNA做标准品则这里有一个假设前提就是逆转录效率是一致的.
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