【求助】real-time PCR 关于融解曲线的疑问

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标题:【求助】real-time PCR 关于融解曲线的疑问

穿越时空[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问融解曲线虽然为单峰,但峰看起来有点宽说明什么?谢谢

ero11[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们是因为仪器设置，也出现这个情况，你可以改一下，工具栏上面，第11个，2旁边那个，好像连加符号，点下，出现对话框，analysis term settings ,点下smoothing,吧moving average里的两项都改成3，下面的改成0.25确定即可

summerxx[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

融解曲线越窄越尖锐，说明产物越纯，表达丰度越高，相反，如果峰比较宽，说明产物不是很纯，如果跑电泳，是目标条带附近（很近）有弥散带。
融解曲线是温度——荧光信号的一阶负导数的二维曲线，我们通常所说的融解曲线，实际上是通过温度——荧光数据计算后的曲线，二楼所说的是数据处理的方法，由于实际上实验得到的是离散数据，所以在数据处理时的方法会导致融解曲线看起来变宽或者变窄。在分析方法一致的情况下，融解曲线表征的是产物纯度，高度表示的是表达丰度。

txwuyan[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的目的基因的融解曲线没有主峰，只有2个较宽的峰，而且峰宽且低，是什么原因？内参的融解曲线，主峰最高点所对应的温度是87.5度，在最后95度时有点上翘，是什么原因呢？
验证引物，只看融解曲线救可以吗？
刚刚开始试验，特此请教。

woshi[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议把融解曲线图贴上来看看分析会更清楚一些。
如果目的基因的融解曲线没有主峰，那么说明没有目标产物的扩增，或者说是目标产物扩增的很少。2个较宽的峰，如果Tm在80度以下，多半是引物二聚体，如果在80度以上，可能是非特异性扩增。一般宽的峰电泳结果表征的像弥散带。
95度时有点上翘没有关系，跟仪器或者仪器的分析软件相关，最好贴张图看看，上翘的是什么情况，应该与实验没有太大关系。
验证引物，最好还是跑电泳，电泳的结果是最直观和准确的，融解曲线只是染料法的一张辅助分析手段（染料法相对探针法来说，特异性不足）。
一般做定量PCR的步骤：1、常规PCR，摸索实验条件、验证试验体系，结合电泳进行分析；2、定量PCR，通过扩增曲线进行绝对定量或相对定量，染料法可结合融解曲线进行扩增产物的特异性分析。
即便是做定量PCR，建议最好也要跑个电泳，如果发文章的话，放上扩增曲线，Ct值分析结果、融解曲线，再加上漂亮的电泳图，就比较有说服力了。

whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好。我最近利用takara荧光试剂盒进行荧光定量PCR，所使用的仪器是rotor gene3000.试验已经进行一个半月，预试验尚未成功。荧光扩增曲线还行，CT值大约在20-25之间，各期均较明显。但是溶解曲线有多峰，并且内参也出现双峰。咨询师兄师姐均无应用rotor gene3000进行试验的。我想请教一下关于rotor gene 3000的PCR大体反应条件，以及我的引物是否合适。（见附图）还有进行普通PCR验证引物的特异性时所需的PCR条件是多少，怎么设定？是根据文献吗？还是根据说明书自己摸索？若普通PCR跑出的电泳很好，是否可以利用普通PCR的条件进行荧光定量PCR？

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2015-10-7 16:41

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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

溶解曲线有多个小峰，并且内参没有主峰。希望指教！感激不尽呀！

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2015-10-7 16:41

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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

溶解曲线有多个小峰，并且内参没有主峰。希望指教！感激不尽呀！

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2015-10-7 16:42

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loli[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Corbett的仪器还是不错的，rotor gene 3000使用20~40ul的体系可能会比较好，我也没用过，不过看过不少资料，rotor gene的温控一致性要优于板式的PCR。
反应体系来说，如果你使用takara的试剂盒，好像试剂盒是有针对不用仪器的推荐条件的，如果里面没有针对rotor gene3000的，就可以参照roche的体系配置，至于实验条件的设置，rotor gene的升降温速度没有roche那么快，倒是可以参照ABI 7300或7500.
从融解曲线的结果来看，扩增产物中存在引物二聚体和一些非特异性扩增产物，至于实验条件，个人建议根据试剂说明书的推荐自己再摸索一下。一般比较重要的是退火温度，退火温度提高一些，引物二聚体会减少，但太高会影响目标产物的量。根据引物对退火温度精度的要求不同，可以在2~4度附近、上下进行调整，如果普通PCR电泳好，当然可以借用普通PCR的条件，只不过体系配置上要加入染料，还要进行一些调整，实验条件上要看看荧光定量PCR仪器的升降温速度，照搬过来的条件有时不一定适用，但在2度之内改变下退火温度，一般就可以了。
个人的一点建议，不一定有用，呵呵

yayya[使用道具]
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发表于 2015-10-7 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位好:我是实验新手,最近也利用染料进行荧光定量PCR,出现一些问题，请各位大侠指点.我的扩增曲线基本算是可以,但是溶解曲线出现双峰,即在主峰前面有1-2个小峰.考虑为引物二聚体,提高退火温度从60-66度,减少引物的量,仍然有峰,并且峰无明显消退的趋势,请问各位是什么原因?还需要怎么改进?多谢指点不胜感激!

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