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标题:【求助】外周血淋巴细胞的RNA提取

JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】外周血淋巴细胞的RNA提取


我要做外周血淋巴细胞的RNA提取,请问我是采完血后一个一提呢,还是先冻存在液氮中,一起做?
冻存后会不会影响RNA的量?
请赐教.
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cocacola[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这需要看你自己的情况,如果标本每次只有少数几个,而后续工作,如RT,或者其他,均已准备好,你抽一个做一个也无妨,但是从你的情况推测,你目前只是在收集标本,所以建议:采血后立即用液氮冷冻,然后可以在-70度冻存,直到你开始抽提RNA,这样不会影响RNA质量,当然,如果你采的血量多,可能多次抽提,那你最好在液氮冷冻前先分管装好,这样可以避免溶解血标本的需要.
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢您.还想问一下,用液氮冷冻时,是否加冷冻液?
是一直在液氮内放着好,还是然后放-70度冰箱里好?
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不用放冷冻液，直接放液氮里。冻好后再放-70即可。只要操作迅速（速冻细胞），RNA的质量就不会受影响。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的意见是可以先提出细胞（采血用EDTA或枸橼酸钾钠抗凝）来，再低温保存细胞，然后一起提RNA，再做其他如RT-PCR什么的
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seagate[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好不要全血冻存，否则再溶解时容易导致溶血，影响淋巴细胞的分离。可以在分离出淋巴细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。若用TRIZOL试剂提取总RNA，可将TRIZOL加入淋巴细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。 这两种方法都不会影响RNA的质量，而且同一个一个提取标本相比，攒一批标本同时提取，可减少因提取标本造成的误差，实验结果更为准确。
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 小中大

想问: 为什么要在淋巴细胞中加TRIzol后冻存呢?必须加吗?加多少?加完后再抽提RNA时怎么算TRIzol的量?,
另外,先冻在液氮,然后放在--70度冰箱.想问:一直放液氮里行吗?放在液氮多久算冻好了,然后放冰箱?
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发表于 2015-10-7 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不作细胞培养时对细胞的冻存要求并不高，冻存前不加也行，但保存条件可能相应要高，因为要避免冻融过程对细胞的损伤影响RNA的质量。加TRIzol后，室温５分钟即可将细胞裂解，可能此时冻存缓冲能力高些吧，我不太清楚其原理，是我导师要求我这样做的，当时没考虑这么多。我当时放在－２０度冻存，如果时间相对较长，你可以考虑冻存在－８０度或－７０度，我个人认为如果不做细胞培养，仅提RNA的话，不必液氮冻存。加入的TRIzol的量可根据说明书计算一下，取决于你的细胞数的多少，一步加足，以后溶解后直接进行后续步骤即可。
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发表于 2015-10-7 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室用全血提取PBMC做RTPCR,好多人全血都是肝素锂的抗凝管抽的血，做RTPCR 好像没有问题，为什么楼上有几位强调做RTPCR全血要EDTA 或者枸橼酸钠抗凝呢？我现在正在收集病人标本，希望有人将抗凝剂要这样讲究的道理说来听听。多谢了！
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seagate[使用道具]
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发表于 2015-10-7 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

肝素的影响有以下几点：
1、可能与肝素是一种带强负电荷的粘多糖硫酸酯有关，肝素能与细胞膜表面的膜蛋白，引起细胞膜表面的通透性改变。此外，肝素能结合并激活全血中多种蛋白酶原和补体系统，由此引起一系列酶学效应使DNA在提取过程中不断降解。
2、肝素会对PCR反应过程的强烈抑制作用，其原因是肝素有强大的负电荷，在全血DNA抽提过程中，不能被酚、氯仿祛除，亦不能被乙醇沉淀、洗涤祛除，从而不可避免的被带入PCR反应体系。通过以下途径影响：（1）肝素对DNA聚合酶有强大的亲合力，这样，DNA聚合酶就不能与Mg2+离子作用，形成正确的亲引物-模板复合体的活性中心；此外，有强大的负电荷的肝素与DNA聚合酶结合后，与同样带有较高负电荷的模板DNA之间产生排斥作用，从而使活性中心作用的空间位阻增大，这样，未活化或未充分活化的DNA聚合酶与引物-模板复合体低效率作用，使引物不能延伸或延伸不完全，势必对PCR造成影响；另外，细胞破碎，DNA抽提过程中肝素能与多种蛋白如低密度脂蛋白，多种酶原，补体等结合，并将这些蛋白带入PCR体系，导致PCR效率下降。（2）肝素影响PCR反应体系Mg2+离子的浓度，肝素有强大的负电荷，有较强的中和阳离子的能力，可与体系内的Mg2+、K+特别是Mg2+结合，使作为PCR反应体系DNA聚合酶的辅助因子的Mg2+浓度下降，从而使PCR效率下降或失败。
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