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标题:【讨论帖】普通PCR技术

misswu61[使用道具]
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发表于 2015-10-9 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
庆祝开张！
做PCR也有一段时间了，有成功也有失败，前面很多战友说到了自己实验中的一些心得，我非常赞同，下面是自己的一点经验，与大家分享：
PCR过程的第一步提取RNA是关键的关键，好的RNA等于实验成功了一半。有的组织富含RNA酶，因此提取的方法和一般组织不同。我做胰腺组织提取RNA开始的时候结果不好，后来采用一些措施后提高了RNA的质量。一是组织离体后迅速液氮速冻过夜，然后转如-70°保存。我们在剖杀动物的时候，取一个人取组织，另一个人完成立即液氮速冻，不要等到全部的组织取完后一起速冻（个人感觉这样不好，尤其是对胰腺组织）。二是采用RNA保存液。RNA保存液很多公司都有，国外的很贵，国内的公司价格我们可以接受，效果也不错。注意RNA保存液的使用方法（说明书上有详尽的解释），我感觉其中最重要的2条是：a：组织一定要浸没到保存液中。4°过夜保证组织被保存液完全渗透，达到抑制内源性RNA酶的效果，然后可以选择更低的温度保存；b：组织保存前应该削剪成小块（有利于液体渗透），注意保存液与组织体积比例（1：10），这个比例我想应该是利于液体渗透吧。上述2种保存组织的方法我都试过，结果还不错。
个人感觉组织匀浆还是一个一个完成最好，先从-70°取出一个标本完成匀浆，然后再做下一个标本。不要同时完成多个匀浆。切忌提取RNA质量比速度重要的多！一份好的RNA可以节约你很多时间和精力。完成匀浆的组织样本放在trizol里面是安全的，因为trizol里面也含有RNA酶的抑制成分。
最后，RNA沉淀溶解后需要测定OD260、OD280以明确其浓度和质量。我们实验室做RT和PCR都是采用成品的试剂盒，试剂盒最大的优势是条件和材料已经配置好了，直接按照操作说明进行即可。其中RT一步规定了RNA的用量，因此测定OD260明确RNA浓度后是为了决定RNA的用量，这一步骤很关键，千万不要嫌麻烦，因为做好了RT才能得到好的cDNA嘛！
其余的步骤没有什么说的了，总之我感觉PCR关键是前面标本的保存，高质量RNA的提取以及定量，只要前面的RNA保证了质量，RT得到好的cDNA，后面PCR的过程相对容易一些。如果前面的过程没有质量保证，后面结果不如人意的时候，分析原因就比较复杂了。所谓磨刀不误砍柴就是这个道理。
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发表于 2015-10-9 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一点感受
PCR这东西奇怪的很，让人既明白又糊涂，没法让人琢磨透。刚工作时，自觉着做了几年PCR，对PCR了如指掌，信心百倍给研究生指导实验，没过多长时间发现曾经是那样熟悉的PCR变得如此的陌生，从此不再对外称是PCR专家，我相信即便是天才Mullis也不会自称是PCR专家的。
后经分析，虽然绝大部分问题能自己解决掉，但是还有一部分问题依然困惑着我。
我觉得PCR不在于是不是能扩增出带来，而是在于是不是有重复性、是不是有统计性、有没有设对照，其实这3点做任何实验都需要的，尤其是对照，前两点对分析单次实验结果可能影响不大，但对照就不一样了，如果PCR有问题，没有对照很难分析原因的，即便是PCR出的带很好，没有对照也无法说明是不是假阳性，关键还是对照。但我了解，好多学生往往省掉了对照。但我建议做PCR至少要加一个阴性对照，再加的话加阳性对照，单引物对照。阴性对照设定也有学问，好多都是直接拿水替代模板，如果是RT-PCR的话，我都是拿RT时的阴性对照（不加逆转录酶的反应）做PCR时的阴性对照，再加水阴性对照。如果提取总RNA中有基因组污染的话，很容易识别了。
祝大家好运
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发表于 2015-10-9 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谈点我自己的心得
做PCR也有半年多了,感觉做RT-PCR比普通PCR难多了,做RT-PCR的过程中出现了许多的问题,比如重复性差,有抹带等.我个人觉得好的RNA是最重要的,楼上已经谈了提RNA的注意事项了,我就不多说了.重复性差还是由于模板量少.看文献上做我这个基因反转录RNA要1ug就够了,cDNA加1ul,但我反复试的结果是加到2ug,重复性才好,这也有可能是我处理的该基因表达少,再就是分光光度计测的不准喽.
至于抹带这个问题,我到现在都没弄明白,有的说是由于酶过量,Mg离子或dNTP过量,循环数多等原因造成的.但我觉得我的实验抹带不是这些原因,因为同样的条件有时有抹带,有时没有.奇怪的是刚反转录出的cDNA做就比较容易扩出单一条带,CDNA用个两三次后,就老是有抹带.不知道是不是cDNA反复冻融降解了,但文献上都说cDNA很稳定.呵呵
还有我也很同意楼上说的作实验一定要尽心尽力,不可一心二用.急噪时最好先停一下明天再做,因为即使作了也是无用功.我可是深有体会,好奇怪,觉得是一样的做,但尽心时就能作出好结果!
祝大家实验顺利!
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发表于 2015-10-9 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pcr 总是没有条带，只有很长的拖尾，怎么办~请教~！
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wood533[使用道具]
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发表于 2015-10-9 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验马上要开始了,请问一个问题,取的新鲜组织,是不是一定要用液氮研磨.
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wood533 于 2015-10-9 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
实验马上要开始了,请问一个问题,取的新鲜组织,是不是一定要用液氮研磨.

用液氮研磨，目的就是低温减少RNA的降解，个人认为，只要条件允许，还是用液氮研磨好点；新鲜组织可以直接加入TRIzol匀浆。
我们实验室一直以来都是用液氮研磨的，感觉提的RNA质量都还可以。
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发表于 2015-10-9 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚开始做实验，说一点小心得。
因为开始找不到液氮罐，所以我用冰盒取组织，取完后组织冻于-80度冰箱，可以提出RNA。提取效果还不错，但目前不知冰盒取组织后多长时间之内放入冰箱？
我按照国外文献作的，引物没有问题，但其中一篇文章的扩增条件有问题，按他的条件根本没有条带，后来自己摸索的。
cDNA确实很稳定，我冻于-20度冰箱反复用好几次，没问题的。
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发表于 2015-10-9 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚刚开始做PCR，班门弄斧谈点自己的心得和疑惑
我的PCR主要是做基因敲除动物的鉴定，主要针对所敲除的DNA基因片段进行扩增，来判定动物是纯敲除、杂合子抑或是野生型。楼上很多战友谈的都是RT-PCR，相对来说DNA要稳定得多，也不怎么怕污染，我想新手学PCR还是从DNA入手比较合适。实验过程中有些要注意的问题：
1.要注意外部因素的影响，试剂、仪器的改变都可能导致结果不同。我们从分子生物大实验室搬到老板自己的实验室之后几次条带跑的都很淡，经过一番摸索，重新配置了体系，微调了反应温度之后才清晰起来。
2.实验过程中要耐心、仔细。PCR真的是个很玄妙的东西，一些不起眼的小细节都会使实验失败，特别是在同时配制多个样本体系的时候，要在心里数清步骤，不要漏加或者多加；分装的时候装好和未装的ep管要分清；放入PCR仪之前最好在振荡器上震一下，再离心几秒钟，保证没有气泡和附壁；点到胶上的时候每点一个孔就要在电泳槽里洗一下枪头，等等。
3.实验前就要预判体系是否过期，量是否足够，否则后悔都来不及。实验多失败几次，看看条带基本就知道是那个试剂出问题了。我是采取四引物法，其中某一引物过期往往只能跑出两个条带中的一条，而且比较模糊，如果Taq酶出现问题则整个胶都是花的。
最近几次PCR新配了引物，Taq也换了新的，结果都比较满意。最大的疑惑就是在胶的最前端引物二聚体往往非常浓非常亮，有的拖尾比较明显，至今还在思考原因，望高手指点。
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发表于 2015-10-9 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做PCR主要是找脂肪酶基因
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发表于 2015-10-9 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

研究生读了快一年了，上课之余也去实验室做点东西，太高深的做不了，主要还是做PCR测序和RFLP 的，从一开始的菜鸟到如今的游刃有余，有一些心得和感受的，在此与大家分享一些。
最重要的是引物的设计。强烈推荐Primer3 (v. 0.4.0)在线设计网址cuturl('http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi')。一开始用Primer5，可能是个人对于引物设计原则贯彻不透彻，每次设计的引物大约有四分之一扩不出的，其中不乏综合分90以上的。后来改用Primer3 在线设计，只改几个参数，几乎是傻瓜式，但是设计的引物都是超好用^_^有一个片段的区域用Primer5折腾了7对引物都扩不好，改用Primer3 (v. 0.4.0)在线设计就一次OK了
反应条件也很重要，每个实验室都有自己的惯用的试剂和配方，从一个实验室到另一个实验室，试剂和机器换了，最好重做一遍梯度。
还有一个细节，个人感觉除了操作仔细小心外，有一点很重哟，千万别随便更换体系。一开始我每次摸条件时做20ul，之后测序的话就做40ul体系，但是发现总是不如摸条件时的条带理想，后来就都做20ul了，宁可多做几管。
都说PCR是很诡异的东西，有时候突然就不出条带了。我也经历过两次，但都是个人失误，一次是误把未稀释的镁离子原液直接加了，导致一个星期跑胶一片空白，还有一次是急着赶时间，溶引物时溶了两管上游引物，当然什么都没有啦。希望大家不要像我这么不小心
总之普通pcr还是很好伺候的试验，只要你够细心^_^
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