小中大做了将近两个月pcr，时间不长，但酸甜苦辣，个中滋味，只有自己才能体会，在pcr版潜水了两个多月，学到了很多的东西，下面也简单说说我的一些心得，上面战友提到过的一些我就不多说了，希望能对其他战友有所帮助，有所启发，说得不对的时候，也希望战友拍砖。
1 先说污染问题，对于一般的pcr，个人认为没有那么邪乎，去超净台麻烦，我直接在我的实验台操作，tip头高压灭菌，ep管进口的，直接取用，别说口罩，帽子，手套后来我都未戴，也没有发生污染的事，可能也和周围环境有关
2 操作细节：冰上加酶（一般酶的说明书都有说明原因），且放入pcr仪之前，pcr仪需达到94度（即预变性这步），尽可能提高反应特异性。
3 一般pcr，设55、60、65度退火，一般第一次都能p出，如无则设67度和50度，再无换引物
4 对于重叠pcr，园子里战友一般讨论模板量太高P不出来，我却碰上了量太少而P不出来的情况，当时怎一个郁闷了得，也对具体情况具体分析有了更深的认识；再有就是不同公司的酶确实有差异，我先用takara的rTaq预试验，然后pyrobest突变，在一段基因上突变了两个，但是到第三个点的时候，死活重叠不出来，整整耽搁了两周，当时都快崩溃了，后来我抱着死马也当活马医的想法试了fermentas的pfu，居然扩出了很清晰的目的条带，今天测序结果发回，三个点全部突变成功，所以实在P不出来时可以试着换下试剂
5 关于2次pcr，我和实验室师姐都碰上了胶回收会再P却p不出来的现象（用takara的回收试剂盒），园子里战友分析说是乙醇残留导致的，后来直接取产物2次p，结果还可
6 原来只是听说dNTP反复冻融会变性，真让我一同学碰上了，大半管的dNTP居然不起作用了。。
pcr过程中会碰到很多问题，碰到问题就要troubleshooting，这才是不断学习的过程，都说pcr很难，但只要多一点细心，多一点恒心，多一点耐心，肯定会得到你所需要的结果，借用在园子里看到的一句话与大家共勉：往往当你崩溃的时候，也就是pcr结果出来的时候！我是真正经历过了，你呢？
