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标题:【求助】SYBR溶解曲线双峰求解

西子[使用道具]
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发表于 2015-10-9 13:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SYBR溶解曲线双峰求解

如图所示，SYBR Q-PCR溶解曲线双峰，不知什么原因，好多次了都是这样，不知什么原因，结果不知可靠否？求解，谢谢了！


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hyuu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议用电泳检测一下定量PCR产物，因为你的产物峰看上去不是很Sharp，怀疑产物并不单一，可能有弥散之类的，如果是这样的话定量结果没有意义。
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西子[使用道具]
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发表于 2015-10-9 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！弥散是什么意思啊？补充一下，前面的峰是一个标本，后面的峰是另外一个标本，有没有可能突变之类的呢？
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hyuu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 西子 的帖子

弥散就是一般所说的smear，电泳中看上去没有特意条带，会呈现出泳道内一段区域均匀分布着产物的现象。至于是否有突变个人觉得不太好说，如果你电泳检测没问题的话可以送去测序鉴定。但是普通定量的熔链曲线是不能用于检测突变的，需要用高分辨熔链曲线（HRM)。
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-10-9 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个结果应该可以用的，可以大概的跑下电泳看看，如果不是这个基因目的片段区域有多态性存在，那就可能是仪器本身的的信号采集时的问题，起始位置几乎相同
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bgf5[使用道具]
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发表于 2015-10-9 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般情况下，如果qPCR溶解曲线出现双峰的情况，是由于引物的非特异性扩增引起的，可以重新设计引物。
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发表于 2015-10-9 13:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
继续发几张，总是出现不同的峰，准备跑个胶试试


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发表于 2015-10-9 13:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 hyuu 于 2015-10-9 13:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
弥散就是一般所说的smear，电泳中看上去没有特意条带，会呈现出泳道内一段区域均匀分布着产物的现象。至于是否有突变个人觉得不太好说，如果你电泳检测没问题的话可以送去测序鉴定。但是普通定量的熔链曲线是不能用于检测 ...

多谢解答，还有点疑虑请教。引物经过简单PCR跑胶验证过，有明显的条带。那么为什么SYBR定量PCR就扩不出来特意条带呢？
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发表于 2015-10-9 14:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 西子 于 2015-10-9 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢解答，还有点疑虑请教。引物经过简单PCR跑胶验证过，有明显的条带。那么为什么SYBR定量PCR就扩不出来特意条带呢？

你用的SYBR是商品化的Mix吗？如果是的话我就不清楚了。如果是自己配的Mix，那么确认配方正确，因为SYBR本身对PCR有抑制作用，需要多加镁离子。所以严格来说普通PCR好的话定量不一定就好。但是商品化的Mix一般没这个问题。
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hyuu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 西子 于 2015-10-9 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢解答，还有点疑虑请教。引物经过简单PCR跑胶验证过，有明显的条带。那么为什么SYBR定量PCR就扩不出来特意条带呢？

你后面放的黄色曲线一定有杂带的。
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