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标题:【求助】PCR产物为何拖带？

dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物为何拖带？


我最近的PCR产物跑电泳时不知为何变成了大片的拖带，以前跑的条带一直很好现在的PCR条件和以前的是一样的。是引物出问题了吗？请各位高人指点，万分感激！
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xevin[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是模板加多了?
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nn255[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的是否是新提取的DNA,会不是新提取的DNA中含有的杂质有点多呢?比如说,盐离子呀等,还有你的摸板是否由于经过保存后有断裂的现象呢?就是在你操作时由于用力有点猛使得造成是机械剪却呢
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我估计和模板没有什么关系，因为我用DEPC替代模板作为空白对照，同样出现明显的拖带，我又用以前成功扩增的模板重新PCR，还是出现拖带。我怀疑会不会是我的体系里面存在对引物有降解作用的物质，破坏了引物，请大家帮帮忙，谢谢了！
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xevin[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你以前做时没有出现这种情况,会不会是胶和缓冲液的问题呢(不过,我觉得这不大可能呀),排除你的循环数和摸板与引物的可能.按理来说,你的对照也出现这种问题,你的这种情况让人想不明白.
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loli[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵，你做的什么PCR，我做ISSR，用的是简并引物，大部分引物的空白都做出了这一现象，找老师问，他们说简并引物做出这种现象是比较正常的。
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发表于 2015-10-9 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是普通的PCR。我的反应体系是这样的：模板 1 ul , Tag酶 1.5U, Mgcl2 2.5ul,
Buffer 2.5ul , dNTP 0.5ul,上下游引物各1ul,DEPC水 15ul,反应条件：94度预变性5分钟，94度变性40秒，60度退火30秒，72度延伸1分钟，共40个循环，最后再延伸7分钟。以前一直是这样扩增的，产物就是一条很清晰的条带，现在不知道什么环节出了问题，每次扩增都是大片的拖带，目的片断根本无法分辨。请大家帮我出出主意，谢谢了！
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做Pcr产生smear的原因如下：
1.模板不纯
2.tm偏低
3.酶量过高
4.dntp，mg的浓度过高
5.循环次数过多
6.引物量太多
个人认为：
1.你的taq酶加的量较多，循环的最适次数是25～35，因为你加的dntp是一定量的。
2.还有就是做pcr是用高压的无菌三蒸水就可以了，没有必要也不应该用depc水，因作pcr是尽量使成分单纯，以避免对实验的影响。作rt时才应该用depc水。
3.一般引物加0.5ul就足够了
4.你是否找下模板的原因，例如是否降解？
个人意见，供参考，希望对你有帮助！
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是缓冲液出现问题了，换新的跑跑看！
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-10-9 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用DEPC替代模板作为空白对照，同样出现明显的拖带，我又用以前成功扩增的模板重新PCR，还是出现拖带。引物我也用过0.5ul试过，但是一样有拖带。如果是循环数太多的话，那为什么我以前用同样的反应参数可以扩增出非常漂亮的条带呢？而现在的情况是拖带十分严重，根本无法判断目的条带有没有存在，请大家指点，谢谢各位！
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