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具体步骤(这《微生物学实验技术》上的,可行):
(1)DNA提取 参照地衣芽胞杆菌染色体DNA提取方法,提取普通变形杆菌和E.coli K-12的DNA,并分别用0.1×SSC溶液溶解并稀释,使测定用DNA的最终浓度为A260nm=0.15~0.30,纯度为A260:A280:A230≥1:0.515:0.450。
(2)将带测菌株普通变形杆菌DNA的参比菌株E.coli K-12的DNA分别装入两只石英比色杯中,塞好带有晶体管点温度计热敏电阻探头的塞子,另一带塞子的石英比色杯装入0.1×SSC作空白对照。
(3)比色杯放入分光光度计的带有加热装置的比色架内,固定波长在260nm。
(4)迅速将比色杯内的温度上升到50℃左右,取出比色杯检查有无气泡,如有气泡用手指轻弹除去。
(5)设置测定程序 按照每分钟升温1℃的速度设置升温程序,具体的设置方法按仪器使用说明进行。
(6)测定终点判断 从50℃开始继续加热,同时记录变性曲线,当温度增加到A260吸收不再增加时即为测定终点。
(7)GC含量计算
在0.1×SSC溶液中,G+C mol%的计算公式为:
G+C mol%=51.2+2.08×(Tm(X)- Tm(R))
其中Tm(X)为待测菌Tm值,Tm(R)为E.coli K-12的的Tm值