PCR仪

最近一直在做QPCR，由于基因比较特别，因此，在确定引物上花了好大一番功夫，才找到了一对即没有二聚体，也没有非特异性扩增的引物。一直在扩增上没有什么大问题。
然后，大约1个月没有做实验。
结果，结果现在再做实验时，发现，又出现的头痛的二聚体。不知道是什么原因，换过了酶，重新稀释了引物，连QPCR仪也换过了，还是一样的。为什么隔了一断时间不做之后，扩增的结果就不一样了呢？应该怎么去解决呢？
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不知楼主是如何检测没有引物二聚体等非异性扩增的？如果是普通PCR方法检测的，这就不奇怪了。
1.引物特异性不好。可以从融解曲线及NTC的结果判断，只能是建议重新设计引物了。
2.还要考虑到一点，是否是因为时间过长，模板降解，产生了非特异性扩增。
3.反应条件的调整，二步法，退火温度提高。
4.还要一点，也是很重要的，可以采用特异性好的试剂扩增。Takara有款DRR820，特异性就很好。

1.关于操作不规范是这样的,比如我们几个同学一起做定量,用的试剂,模板,引物,仪器啊什么都是一样的,但有的同学就能做出引物二聚体,有的就没有,所以说引物应该是没问题的,那不同之处就在于操作。老师说不能操作太暴力，轻柔一点比较好。
2.你的目的基因的丰度太低了，不能加大一些模板量？CT值35，36是不是太靠后了？这样能接受吗？我们这边都得35以前。
3.你的NTC中就是什么扩增？也没有引物二聚体啊？一般如果是引物二聚体，在NTC的融解曲线中看得比较明显，TM值大约在70-78左右。污不污染还是应该看NTC的扩增，量小的话，跑胶是看不出来的。
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1.第一点我赞同。有时候不同的人操作，好像结果确实会不太一样。不过，对于这一点我也无法去进行很明显的改进。
2.我的样本量非常少，然后基因的丰度又很低。模板量实在不能再往上加了：我的样本是用Mini Kit抽，加水量是用的最小洗脱量，反转出来的CDNA都不稀释直接上量1ul进行QPCR。有的CT值超过32都认为不能接受。我是想着如果NTC在40个都没有扩增的话，那我就接受35，36.
3.NTC是水扩增，溶解曲线里没有任何产物扩增峰或二聚体峰，电泳没有可见条带。