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标题:【求助】为什么我只有溶解曲线，而没有扩增曲线？

fox_79[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么我只有溶解曲线，而没有扩增曲线？

刚开始做Real time PCR，做了几次，每次都是只有溶解曲线，而没有扩增曲线？大家能告诉我原因吗？
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woshi[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
你是不是在扩增的时候没有读板？把你的反应程序传上来看一下呢，我们实验室反应程序基本上如下：
94 c 3min
94 c 30sec
60 c 30sec
72 c 45sec
78 c 1sec
read plate
Goto line 2 for 39 more times
72 c 10min
Melting curve from 65 to 98 ,every 1.0 C,hold 1 sec ,read plate
72 c 5min
我们基本上都是这样做的，还没有遇到过你说的这种情况。
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seagate[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

95c 5mim
95c 15s
60c 60s
read plate
Goto line 2 for 40 more times
95c 60s
55c 30s
read plate
95c 30s
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pore[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得你没有得到扩增曲线可能是跟你的反应程序有关，你的反应程序只有变性和退火两步，没有延伸，产物都没有扩增，荧光信号当然不会增加了．为什么你溶解曲线分析的时候，只做了两个温度呢？做两个温度的溶解曲线是什么样？你能不能把你溶解曲线传上来看一下呢？建议你按我上面的反应程序做一下，祝你好运！
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
反应程序,我的退火和延伸在同一步里,当目的基因的片段在150 bp以下的时候是可以将退火和延伸合为一步的,我先做一般PCR,跑胶的时候跑出来的.这一步应该没什么问题的.做溶解曲线的时候我是按电脑默认的程序做的,因为我对溶解曲线的设定不熟悉.但是还是可以看得到溶解曲线,所以我认为溶解曲线是做出来了的.
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://pickup.mofile.com/0461953493565402')
请在这里提取

[ 本帖最后由 fox_79 于 2015-10-9 16:54 编辑 ]
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从你的溶解曲线来看，应该说你的ＰＣＲ没什么问题，而且产物比较单一。不知道你用的哪家公司的定量ＰＣＲ仪，因为不同仪器反应程序的设置可能不一样，建议你把仪器的操作手册再仔细研究一下。或者把你所用的仪器型号说一下，或许有其他战友用过相同的仪器，这样就能更有针对性的帮你。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是Mx3000p.
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65urh[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我正在做Q-PCR,用染料的方法,使用的是ABI7300,但是,40个循环跑完之后,要进行溶解曲线分析,但这个仪器我不会用.哪位战友能告诉我具体的做溶解曲线的步骤,先谢了
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天去和实验室里负责Real time PCR的老师请教了下,我仪器的程序设置是没有问题的.她也说自己从来没有遇到过这种情况.但和她的交流中,我似乎发觉了原因的所在,明天再做一次试下.如果是那个原因的话,将和大家一起分享我的经验教训.
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