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标题:【求助】为什么我只有溶解曲线，而没有扩增曲线？

qhyu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我正在做Q-PCR,用染料的方法,使用的是ABI7300,但是,40个循环跑完之后,要进行溶解曲线分析,但这个仪器我不会用.哪位战友能告诉我具体的做溶解曲线的步骤,先谢了

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我的实验室也是ABI7300，但还没有开始做。不知你有没有完整的作业知道书。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是不是在扩增的时候没有读板？把你的反应程序传上来看一下呢，我们实验室反应程序基本上如下：
94 c 3min
94 c 30sec
60 c 30sec
72 c 45sec
78 c 1sec
read plate
Goto line 2 for 39 more times
72 c 10min
Melting curve from 65 to 98 ,every 1.0 C,hold 1 sec ,read plate
72 c 5min
我们基本上都是这样做的，还没有遇到过你说的这种情况。
......

===========================================================================================================

你好，我一看你的帖子就知道你是高手，我有一个问题，我做的病毒类的real-time PCR，这个时间、温度设定可否和你的一样？谢谢了
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发表于 2015-10-9 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉的有溶解曲线就应该用扩增曲线，除非溶解曲线为引物二聚体的，（但你的常规PCR跑胶没问题），我用ABI 7300做的
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bojitu[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的扩增曲线，溶解曲线都有，其他问题指的是什？结果分析？分析结果还的把PCR结果导入分析模块中进行（ABI 7300）
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rfv[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR 的退火温度，我觉得你还是要做一个温度梯度PCR，然后跑胶，在紫外光下观察，那个温度下P出来的条带最亮，从而找出你的引物的最佳退火温度。至于变性，退火，延伸时间，这要根据你扩增的目的片段的大小来决定。一般来说，Taq酶的扩增速度是1000bp/s，所以你可以根据你的产物大小来决定你反应的时间。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-10-9 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的扩增曲线，溶解曲线都有，其他问题指的是什？结果分析？分析结果还的把PCR结果导入分析模块中进行（ABI 7300）

==========================

我的基线和域值呢?
另外我的其他结果是没有的.
就只有这这2张图的结果.
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发表于 2015-10-9 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 fox_79 于 2015-10-9 16:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的扩增曲线，溶解曲线都有，其他问题指的是什？结果分析？分析结果还的把PCR结果导入分析模块中进行（ABI 7300）

==========================

我的基线和域值呢?
另外我的其他结果是没有的.
就只有这这2张图的结果. ...

在Fluorescence栏下选择dRn项（不选R），然后Threshold fluorescence下就出现阈值，阈值线也会出现。
因为你做的样本是未知类型，所以不会有标准曲线，只会有扩增曲线和融解曲线。
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发表于 2015-10-9 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你下载附件后解压，2张图可以直接打开，1个文件用SDS软件打开，可以看到条件设置，并可以数据分析
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发表于 2015-10-9 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得原因是你的模板量太高,PCR扩增没有使荧光量相对背景荧光而言没有得到增加,而你的溶解曲线是你的模板的溶解曲线.
稀释模板应该能够解决这个问题.
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TNT[使用道具]
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发表于 2015-10-9 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你下载附件后解压，2张图可以直接打开，1个文件用SDS软件打开，可以看到条件设置，并可以数据分析（上面发错了，忘了+附件）
请帮忙看看我的数据,没有基线,怎么感觉曲线那么不好呢?
还有要做溶解曲线,操作步骤是什么?
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