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标题:专攻PCR，有问题尽管问！

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问TaqMan探针有没有保质期，最长能够保存多久（稀释后）？

答：-20度保存，10-12个月没有问题。更长时间就不知道了。
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米囡[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问如何选择TAQMAN探针？  
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发表于 2011-9-19 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教Mg2+对Ex taq酶的活性有什么样的影响，一般什么情况下加入？
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花裙子[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问taq酶的活性在常温下能保持活性多久？在线等！thanks
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发表于 2011-9-19 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的PCR产物电泳时条带很弱，今天我将模板加量、引物及酶加倍，感觉好一些，但仍不理想，我的退火温度已经降到50度了，但是没有非特异带，酶的质量应该没问题，因为别的产物已经扩出来了。不知还有什么办法。  
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问如何选择TAQMAN探针？

答：可以到ABI公司的网页看一看，有参考文献。
cuturl('http://www.appliedbiosystems.com.cn/chinese/pe_h2-add1.html')

另外，ABI公司有相关的引物及TaqMan探针设计软件。很好用的。
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Mg++对taq酶的活性是必须的，合适的Mg++使taq酶的活性发挥到最佳。故在PCR反应时应调节Mg++（因dNTP 引物等可以结合Mg++）。

至于taq酶的活性在常温下能保持活性多久，没有定论。不同厂家不同批次的酶差异较大。一般应尽量使其处于低温。一般液态的taq酶，不易保存，在常温下，放几个小时应该问题不大。固相化的热启动taq酶（如华美公司4度PCR试剂盒内的酶管），常温下放置一个月应该问题不大。
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好回答。不过建议采用以下策略试一试：
1。在降退火温度，可以低到45度
2。增加Mg++的浓度
3。将延伸时间加长
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Ex Taq酶 是一种高保真的 Taq酶 ,但是一些PCR返应试剂盒中有的含有Mgcl2有的没有Mgcl2,如下面网站所提供的.
cuturl('http://www.takara.com.cn/asp/product/zh/takaraextaqtm.htm')

专业性较强,理解不透.并且在它所给的几种血样处理中,并没有在PCR反应体系中加入Mgcl2.
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我使用两对引物在同一体系中扩增两个目标产物,照说应该是非竞争性PCR,可是在两种目标产物浓度一样的时候由于扩增效率的不同两者的CT值相差始终存在>1的情况,请问各位有什么方法可以使两个目标产物的CT值尽量接近呢?
还有就是PCR的重复性问题,同一标本不同锅的测试,结果却相差很大,如何建立一个标准体系来平衡批间误差,我想合成我的目标产物作标准曲线来解决不知道可不可行,希望你们能给我更好的办法!谢谢!!
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