专攻PCR，有问题尽管问！ - 经验共享

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标题:专攻PCR，有问题尽管问！

魔法师A[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有谁能帮我解决相对定量时内参和目标产物的扩增效率问题？
我用的反应体系为50ul：
１０＊PCR buffer 1 ＊(终浓度）
　　　　　　　　　　２mmol/l　dNTP 0.2mmol/l每种
TaQnase 5U/IU 1U/50ul
25mmol/l Mgcl2 2.5mmol/l
intel reference Primer 1F 1umol/l
1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
target Primer 1F 1umol/l
1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
Template 0.05ng--0.005ng
循环条件:94 5min 1cycle -------- 95 30sec 60 30sec 45cycle
在内参和目标基因初浓度一样的情况下,如何避免竞争抑制使两个基因的扩增效率一致且相对比值接近1呢? [/co

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Ex Taq酶是一种高保真的 Taq酶 ,但是一些PCR返应试剂盒中有的含有Mgcl2有的没有Mgcl2,如下面网站所提供的.
cuturl('http://www.takara.com.cn/asp/product/zh/takaraextaqtm.htm')

专业性较强,理解不透.并且在它所给的几种血样处理中,并没有在PCR反应体系中加入Mgcl2.

======================================================================

网站所提供的内容我看了。加入Mgcl2是肯定的。如10XBUFFER含有镁离子就不需要再加了。

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我使用两对引物在同一体系中扩增两个目标产物,照说应该是非竞争性PCR,可是在两种目标产物浓度一样的时候由于扩增效率的不同两者的CT值相差始终存在>1的情况,请问各位有什么方法可以使两个目标产物的CT值尽量接近呢?
还有就是PCR的重复性问题,同一标本不同锅的测试,结果却相差很大,如何建立一个标准体系来平衡批间误差,我想合成我的目标产物作标准曲线来解决不知道可不可行,希望你们能给我更好的办法!谢谢!

======================================

1，可以调整引物与探针之间的比例，使其接近于1
2，合成目标产物作标准曲线是可行的。

ha111[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以调整引物与探针之间的比例，使其接近于1

我的目标产物和内对照基因在相同浓度的情况下，要如何调整两对引物和探针的比例呢，我的反应体系如下：
反应体系为50ul：
１０＊PCR buffer 　　　　　　　　1＊(终浓度）
　　２mmol/l　dNTP 　　　　　　0.2mmol/l每种
　　TaQnase　 5U/IU 　　　　　　1U/50ul
　　25mmol/l　　　　　　　　　 Mgcl2 2.5mmol/l
intel reference Primer 1F 1umol/l　　1R 1umol/l
intel　refenrence　MGB probe 　　　0.25umol/l
target Primer 1F 1umol/l　　　　　1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
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guagua[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2011-9-19 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

实验是靠自己做的，别人只能给你提一些建议，我这里没有protocol。至于引物与探针之间的比例，可以1：1，1：2，1：3的多设计几组进行调节。

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

太好了！我有问题！
我想检测细胞里面TGF teba 1,2,3的表达情况！
已经在genbank里面查到三者的mRNA序列，想设计引物做RT-pcr半定量检测。
设计一个基因的引物除了要考虑这个基因的序列本身，难道还要考虑超家族的其他成员吗，需要避开保守区吗？？？
我在网上查了一下，发现有的文献上提供的引物序列，有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，能扩出来目的序列吗？

===============================================================================================================

你的引物设计在哪个部位，自己可以查资料。但设计引物时，不要太相信软件了。经常是有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，却能扩出来目的序列来。

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该是调整引物（目的基因：内标）和探针（目的基因：内标）的比例。

清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=379619&sty=1&tpg=1&age=0

ha111[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不知道怎么回事，PCR的结果总是很奇怪：
可以P出目的片断，但是很弱，然而上样BUFFER前面的那条带倒是很亮（我估计是引物二聚体），每次都有这样的结果，高手能告诉我原因在哪里吗？
我用的引物是五月份合成的，我配好后，只做过一次PCR，当时目的条带很亮，然后冻存在－20度，直到这个月初才拿出来继续做，是不是引物有问题呢？因为我的模板是才抽的质粒，酶切是有目的基因的。

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