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标题:专攻PCR，有问题尽管问！

zhezhe[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人细胞数量有限，达到10的7次方数量的细胞很困难，请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。

此外细胞数量少的话有什么方法可以提高trizol的提取效率？是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？  
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用外文文献中找到的引物和genebank对，若实在找不到，在genebank中找到所要扩增的序列，自己设计引物。
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
重新配置PCR反应混合物。引物冻存在－20度，几月一般没有问题。
建议在重新配置PCR反应混合物时，降低镁离子试一试。或者换用热启动DNA聚合酶。
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1。请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
答：没有定数，这要看你要扩增的mRNA的丰度，一般100000就够了。
2。有什么方法可以提高trizol的提取效率？
答：不知道。
3。是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？
答：对。最好能过夜。
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发表于 2011-9-19 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请帮我看一下，谢谢！！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=381528&sty=1&tpg=1&age=0')  
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麻瓜[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR的初学者,请问如何查出外显子,而且如何知道外显子的顺序?
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细水长流[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我象问你通过降落PCR的复性温度连续降低，如何确定最佳复性温度，哪一个是最佳的
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1。请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
答：没有定数，这要看你要扩增的mRNA的丰度，一般100000就够了。

================================================================================================================

10的5次方个细胞用trizol提取总RNA是否是看不到的，按你上面的说法如果提取的RNA看不到就没有继续做后面的逆转录了，那是否说10的5次方个细胞在实际操作中不太可行？

另外还有一个问题，一般我提取的RNA OD260/OD280在1.6~1.8之间，是否纯度不太好？请问在提取时有什么方法可以提高RNA的纯度吗？纯度低对于后续的操作有什么影响吗？如果OD260/OD280的值在1.6，是否在逆转录时可以适当增加总RNA的量？
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RNA浓度低，肉眼肯定看不见沉淀的,（我提病毒的，才20ug/ML),你可以测OD值及浓度，然后决定RT酶的用量。

“PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。 ”
当然可以！
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
按你t的说法是否是指，加入异丙醇后，离心随后去除上清，即使没有见到沉淀也同样去除上清？然后再用75%酒精洗净？酒精洗的时候尽量不要把看不到的沉淀倒掉？

是否也就是说提取RNA最重要的是保证RNA的纯度，即使OD260/OD280尽可能保证在2.0？而对于提取的用做逆转录的RNA量并不是要求很多？

假使OD260/OD280的比值相对较低些达到1.6是否在逆转录时可以相应增加加入的RNA总量？
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