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标题:专攻PCR，有问题尽管问！

猫屎一号[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教关于长片段基因的PCR问题
请教；我用的是ROCHE 公司的 Expand Long Template PCR System 扩增我的目的基因，但没有目的带。目的基因为2456个bp。反应条件设定为：94度2分一个循环；94度10S，60度30S，68度2分，35循环。68度7分一个循环。请教各位，谢谢。还有如果用普通的Taq酶如何可以保证有低错配率？？
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缘yuan[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
MBI的PCR反应体系提供了两种10xpcr buffer: 一种是无mg2+,一种是内有硫酸铵的，
以前有帖子：铵离子会影响PCR的反映，
为何MBI还要提供此种buffer?
请问，那种PCR需要铵离子，或者说，铵离子的作用是什么？
恳请指点，谢谢！
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很对！100ng即可做逆转录（用invitrogen的superscritII据说50ng即可）
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发表于 2011-9-19 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
让我奇怪的是，现在我提取mRNA的纯度下降了，与我采用的培养基有关系吗？我以前用的是无酚红的1640培养基，而现在用的是高糖的DMEM培养基，请指教！多谢了！
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8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想用RT－PCR钓一个基因，mRNA约3kb，其间还有一个颈环结构，应该如何对付？
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发表于 2011-9-19 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大侠，我最近扩增一个300多个碱基的目的片断，三周前摸条件时还好好的，目的片断条带很亮，退火温度范围也很宽，可现在不是为什么，死活就跑不出来了，即使用原来的模板也跑不出来了，请帮忙分析一下，有可能是哪里出了问题，如何解决，我已经快疯了！我是25ul的体系，cDNA用的是2ul.
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人细胞数量有限，达到10的7次方数量的细胞很困难，请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。

此外细胞数量少的话有什么方法可以提高trizol的提取效率？是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？

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量很少的样品中加入糖原以提高RNA的产率。糖原（低于4mg/ml）的存在，不影响cDNA第一链的合成，也不会影响PCR。细胞量少时（102-104个细胞）加800ul+Trizol（Gibco)，混匀后加入5-10ug的去RNA酶的糖原以得到水相。
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蛐蛐儿[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求救，我现在有一个片断不能扩增出来，引物分别为44和32bp,退火温度分别为
77.8和64.7，片断长度为852bp，引物浓度为20pM。不过引物选的特异性结合序列只有20bp，请问各位我该怎么设定我的反应条件。用的试剂均为Takara产品。
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.本人细胞数量有限，所以在用trizol提取细胞总RNA时，肉眼无法观察到RNA沉淀，请问是否还有必要继续测定RNA的含量。

2.PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。

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这个问题我会：我来顶。
1 细胞有限时，RNA量肯定非常少，不过我认为还是要定量的，关键是看260与280的比值，（如果你定量时用的RNA量太多就不用定了，我们这里只要80ul就够了。）可以直接做PCR， 但是要带上阳性对照，如B-actin。

2 可以。
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-19 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大侠，我最近扩增一个300多个碱基的目的片断，三周前摸条件时还好好的，目的片断条带很亮，退火温度范围也很宽，可现在不是为什么，死活就跑不出来了，即使用原来的模板也跑不出来了，请帮忙分析一下，有可能是哪里出了问题，如何解决，我已经快疯了！我是25ul的体系，cDNA用的是2ul.

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出了问题找原因和很麻烦那。每一步都要有阳性的东东，才能找到真正的原因。一个条件一个条件的换吧
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