【求助】HPLC-IEC 保留时间不一致问题

生物制药 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】HPLC-IEC 保留时间不一致问题

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】HPLC-IEC 保留时间不一致问题

am10[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2015-10-12 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

鄙人在做HPLC-IEC测试样品与原研药电荷一致性时发现，两者保留时间不一致，相差3min.方法一共才35分钟。峰型是一致。在离子交换色谱中，保留时间与样品的电荷量，缓冲液的洗脱比例，缓冲液pH等有关。对于缓冲体系是一致的，样品也统一置换到相同的buffer中，样品的PI值正在送检测试。
想请教各位战友，除了样品本身pI值不一致导致带电量差异，还因从哪些方面考虑这个保留时间不一致的问题？

idea2011[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77656
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2015-10-12 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有一个关键的，温度，如柱温、流动相温度、室内温度

seagate[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 114508
精华 0
积分 601
帖子 922
信誉分 100
可用分 5343
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2015-10-12 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一个配好的流动相，在使用一天后，ph会有一定的变化，保留时间变动很正常。但是你说的三分钟太大了，很可能是你的色谱柱快要挂掉了。你样品里面有什么成分，或者样品不干净。还有一种可能，你使用的液相是不锈钢官路，使用前，要使劲用酸冲一冲，把它钝化一下

nn255[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态离线

发表于 2015-10-12 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

满意答案
我想楼主肯定是在同一台液相上先后进样发现的差别，那么什么柱温、缓冲液等理由应该都不成立。
还有一种可能请楼主注意一下，两个产品是否糖型存在很大差别？糖型差别导致了体积异构，这样有的离子基团没有暴露，因此造成结合能力还是有差别的。

am10[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2015-10-12 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 nn255 于 2015-10-12 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
满意答案
我想楼主肯定是在同一台液相上先后进样发现的差别，那么什么柱温、缓冲液等理由应该都不成立。
还有一种可能请楼主注意一下，两个产品是否糖型存在很大差别？糖型差别导致了体积异构，这样有的离子基团没有暴露，因此 ...

嗯，却为同一液相所检测，样品BUFFER以及流动相均是一致。有考虑到糖型和末端的K。末端的K不至于使峰型整体偏移，正在做切糖之后，两者保留时间是否一致。另外还想请问各位战友，对于PI值，是怎么形成，由哪些原因会导致同一基因序列所翻译的抗体PI值有偏差

mogu[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态离线

发表于 2015-10-12 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 am10 于 2015-10-12 11:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

嗯，却为同一液相所检测，样品BUFFER以及流动相均是一致。有考虑到糖型和末端的K。末端的K不至于使峰型整体偏移，正在做切糖之后，两者保留时间是否一致。另外还想请问各位战友，对于PI值，是怎么形成，由哪些原因会导致同一基 ...

末端的K对峰位的影响还是很大的。另外唾液酸会影响到抗体的PI值。你可以尝试下把末端的K和唾液酸都切掉试试。

am10[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2015-10-12 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 mogu 于 2015-10-12 11:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

末端的K对峰位的影响还是很大的。另外唾液酸会影响到抗体的PI值。你可以尝试下把末端的K和唾液酸都切掉试试。

谢谢战友的回复，如你所说此两者对PI会有很大影响。唾液酸一般是加在半乳糖之后，也属于糖型的影响，通过PGFase酶切脱糖，两者峰型并未一致可知并不是糖型差异影响的，至少不是Fc端的N糖。末端的K的影响，K的存在形式也分为K0，K1，K2，各成分不同导致至少会出3个K峰，保留时间差距也较大，主峰一般为K0峰。但是我认为我的情况也不是K引起，因为峰型一致，是整体的平移，并不是说主峰是K的不同所出位置不同。不过是否是两者共同影响还未实验证实，抽空做做看

HP007[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2015-10-12 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知楼上的结果，原研和样品比较是偏酸还是偏碱？
以前做过PNG-F酶切之后，样品整体往酸性端移动，IEC和CIEF结果都是这样。CPB酶切之后，只是K的峰降低了，位置不变。
如果是K的影响，那二者的主峰很可能是k0和K2（3min差异）的差别，不过主峰一般都是K0吧，至少我碰到的都是这样
如果二者都经PNG-F酶切之后还是相差很多，那真不可能是Fc端-N糖。。o糖？
静待楼主的进一步研究结果

am10[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2015-10-12 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 HP007 于 2015-10-12 11:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知楼上的结果，原研和样品比较是偏酸还是偏碱？
以前做过PNG-F酶切之后，样品整体往酸性端移动，IEC和CIEF结果都是这样。CPB酶切之后，只是K的峰降低了，位置不变。
如果是K的影响，那二者的主峰很可能是k0和K2（3min差异）的差别，不 ...

比原研药偏酸。 PNG-F处理后 N变成D，整体往酸性端偏移，但仍保持三分钟的差异。K我没做，因为是整体偏移，而非主峰偏移，酸碱性峰都有相通差距，故不认为是K的影响。之后做了肽图，肽段存在差异。脱糖后的肽图几个肽段仍有差异。排除N糖影响。O糖还未试。有考虑做肽段覆盖率，确认氨基酸序列是否发生了突变。