【求助】3T3L1分化时飘了，越飘越多，分化不成功 - 经验共享

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标题:【求助】3T3L1分化时飘了，越飘越多，分化不成功

seagate[使用道具]
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发表于 2015-10-14 17:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

As my Experience, before diffirence, the 3T3-L1 has to be very dense otherwise the differenciation would be very bad. From the photo you gave in 220 of Oct, the dencity of the cell is too low to be differenciated.
Gas!!!

雪花子[使用道具]
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发表于 2015-10-14 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 seagate 于 2015-10-14 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

As my Experience, before diffirence, the 3T3-L1 has to be very dense otherwise the differenciation would be very bad. From the photo you gave in 220 of Oct, the dencity of the cell is too low to be d ...

多谢您给出的建议，的确，长满后2天分化的标准方案有它的绝对理由，我曾经试过长满后1,2,3天后分化，发现第一天的分化率严重偏低，基本是散在点状分布，第2天的分化率就很好，第3天再分化，情况比较复杂，有的时候会很好，非常好，有的时候就不好，总结主要和分化前细胞状态有关，长满后如果每天换液，保证细胞足够的养分，能够继续堆积，分化就很好，有时候稍微疏忽一点，细胞长满后很容易飘的很多，这时候分的就不好。
有人建议种皿后长6-7天，就分化，我用3万细胞/ml的密度，种6孔板2ml/孔，细胞基本是3-4天长满，计算下来也约是6天左右分化，我们有同学还是过用10的倍数梯度种皿，比如3千，3万，5万或更高的倍数种，发现无论如何，到4天左右都长满了，这个我没有尝试，呵呵，反正这个细胞长的确实非常快。
比如，无论你如何稀释，回传的细胞4-5天必须传代，所以这个细胞养的时候真的是非常累啊，不停地传代，种皿，分化，前一批实验结果未出，后一批的细胞必须种下，要不然周期太长，等不了啊。
以我的经验，3万密度种细胞，6天左右分化，效果比较的稳定，但每天查看细胞，根据实际情况分化是需要的。如果新手，可以稍微延长分化前时间，比如7天，但延长并不是绝对的，不是越长越好。
我的细胞长满后2天的图片目前没有，实在好久没有分化了，呵呵，所以养不到那么长的时间，等这批细胞合适的时候，我会种皿尝试分化，到时候请楼上的兄弟再给鉴定一下。
总之，多谢大家的关心和建议，都非常有用。

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发表于 2015-10-14 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 雪花子 于 2015-10-14 17:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢您给出的建议，的确，长满后2天分化的标准方案有它的绝对理由，我曾经试过长满后1,2,3天后分化，发现第一天的分化率严重偏低，基本是散在点状分布，第2天的分化率就很好，第3天再分化，情况比较复杂，有的时候会很好，非常好，有的时 ...

3T3L1分化的标准流程就是要接触抑制2天再去做诱导，这个你应该知道的吧

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发表于 2015-10-14 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我毕业就是靠这个分化的，很容易漂，对环境变化也很敏感。
insulin，地塞米松，分化的培养皿或细胞板，PBS......都会影响

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发表于 2015-10-14 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，抱歉很多术语，我可能说的不标准，以后要注意，改正。
您说的接触抑制，指的是否就是细胞100%长满，英文Protocol上说的是： Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media，我理解是长满后两天开始分化，算作D0。
形态学上大致是细胞铺满瓶底，呈梭形排布，没有空隙，看不见空的瓶底，两天以后，细胞基本条梭状分布，很细，一个挤一个。和散在分布时多角形的形态大有不同。
我上面说的的确有很多不是标准操作，有很多也曾在坛子里看见过，有时候同学们也会互相沟通经验，但的确，标准方案是最通用的，我一直也是以标准方案为标尺。

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发表于 2015-10-14 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 雪花子 于 2015-10-14 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

呵呵，抱歉很多术语，我可能说的不标准，以后要注意，改正。
您说的接触抑制，指的是否就是细胞100%长满，英文Protocol上说的是： Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media，我理解是长满后 ...

对，这两天不仅仅是细胞数量的问题，因为已经接触抑制了，细胞数目不会增加多少，关键是这个过程引入了许多信号通路的变化，最近还有文章报道引入了epigenetic change，所以正常分化实验中这个步骤不是随意可以调节的，但可以作为研究影响分化因素的一个课题来研究。

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发表于 2015-10-14 17:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
真的不愿意承认，但是，事实就是我的细胞污染了支原体，经过测试，现在公布结果。作为一个熟练工人，污染了支原体，实在让我羞于给大家报告，这种失误的确很低级，然后没有最先怀疑这一点，浪费了很多精力和时间在其他方面，这……唉。
同科室的同学做Confocal，顺便染了一个Hoechst，我发现背景不够干净，我怀疑支原体污染，非常怀疑。这是别人做的片子，我就不在这里给大家看了。我建议老板买一个支原体检测的KIT去做PCR，老板很鄙视，觉得花这份钱不值得，他觉得这有60%的可能，细胞直接扔掉就行了。
我也承认，一旦细胞发现支原体污染，直接放弃就得了。但是，我还是想最后确认一下是不是，因为不能用KIT检测，所以我没有所谓的阳性对照，或者阴性对照，那我如何判断这是否是支原体感染呢？
我采用了临床医生常用的一种思路，用抗支原体的抗生素，如果抑制有效，就证明是，如果无效，就可能不是。因为很多时候在临床，很多感染无法确定是什么，只能先用抗生素去杀，然后反过来说这种感染是对什么敏感的。
我的实验设计如下：