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标题:【求助】3T3L1分化时飘了,越飘越多,分化不成功

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第8天,细胞经过2次传代,不加环丙组在细胞生长密度变大时,会出现更多的漂浮细胞或者碎片,与环丙组的差别日趋明显!


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第9天,不加环丙组出现更多的漂浮细胞或者碎片,与环丙组的差别日趋明显!


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第9天,细胞固定,Hoechst染色,confocal镜检,固定染色和镜下的实验条件都完全一样,这是低倍镜下,差异非常明显,非常明显,我不多说了。


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这是高倍镜的,非常明显


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关于分化的那一批,出了匪夷所思的意外,目前没有很好的解释,所以暂不分析,待以后有结果再说。
关于支原体污染,思路迪前辈曾经也说过,常见是血清,细胞交叉,这两项我可以80%确认不是,血清都是hyclone,细胞我只养了这一种,枪头盒等都是每用一次就重新高压,因为细胞处理时间长,早期养的时候(1年前)我也出现过一次霉菌感染,所以已经很注意。
我现在分析最大的可能是细胞房环境不佳,我们细胞房管理很不好,因为有3个Team的同学都在同一个细胞房,大约20人左右,最糟糕的是,因为有的老师不以身作则,直接进去,不换鞋,不穿白大衣,更别说戴口罩了。所以,到今年6月份的时候,所有的人都不换鞋,不穿白大衣,细胞房随进随出,我也很无语,我只是个博士,我不是领导,我跟老板反映过,结果效果不理想,有很多人为地因素,也没什么好说的,我也不发牢骚了。
经过这次事件,我再次提醒老板,终于,上周重新更换了超净工作台的滤芯(还是2003年的),换下来的滤芯惨不忍睹。
更换了换气扇的滤芯,工人说早就坏了,不能用了。我上周每天晚上最后一个到细胞房,用84拖地,然后打开紫外灯后离开。每天早上坚持用消毒液擦拭桌面,培养箱表面,没办法,为了自己的细胞,就这半年了。
终于,细胞房重新贴上规定:请进细胞房前更换专用拖鞋,白大衣。
但愿这次坚持的时间长久一些。
等这次细胞分化顺利之后,我会将3T3L1的分化经验写出来,供大家参考。
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另外,我仔细check了我以前的片子,我在今年初做的一次confocal还是没有支原体污染,hoechst染色我们常规染,这里再给大家看一下,这又一次说明污染和分化相关性。分化好的细胞应该是没有污染的,我做的都是脂肪细胞的confocal。以前的片子颜色调的比较暗,因为不是为了突出核,只是一个定位而已。脂肪细胞又很厚,所以片子不好看。这次的染色比起来要好看些,这次是脂肪前细胞,特此解释一下。而且confocal的老师说我的实验技术又提高了,说现在做的更漂亮了,唉,这个多讽刺啊。
为了让图和文字配上,我发了很多次帖子,实在不知道怎样像博客那样,将图和文字穿插起来,所以请斑竹见谅。


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真的不愿意承认,但是,事实就是我的细胞污染了支原体,经过测试,现在公布结果。作为一个熟练工人,污染了支原体,实在让我羞于给大家报告,这种失误的确很低级,然后没有最先怀疑这一点,浪费了很多精力和时间在其他方面,这……唉。
同科室的同学做Confocal,顺便染了一个Hoechst,我发现背景不够干净,我怀疑支原体污染,非常怀疑。这是别人做的片子,我就不在这里给大家看了。我建议老板买一个支原体检测的KIT,老板很鄙视,觉得花这份钱不值得,他觉得这有60%的可能,细胞直接扔掉就行了。
我也承认,一旦细胞发现支原体污染,直接放弃就得了。但是,我还是想最后确认一下是不是,因为不能用KIT检测,所以我没有所谓的阳性对照,或者阴性对照,那我如何判断这是否是支原体感染呢?
我采用了临床医生常用的一种思路,用抗支原体的抗生素,如果抑制有效,就证明是,如果无效,就可能不是。因为很多时候在临床,很多感染无法确定是什么,只能先用抗生素去杀,然后反过来说这种感染是对什么敏感的。
我的实验设计如下:
......

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最简单的可以做个rtpcr确认,另外,你现在分化做出来了吗?
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LZ我好葱白你。通过这些帖子你让我看到了一个科学家是如何去面对问题,分析问题并解决问题的。上个月开始我的课题也接触到3T3-L1的分化实验,单单是细胞状态问题我就跟它耗了一个多月,想了各种办法还是解决不了,现在还在僵持着。你的经历让我学到了很多,不仅仅是技术上的,更多的是态度上的。谢谢你,也祝你接下来的实验顺利,明年顺利毕业。
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我也正在做这个实验,遇到同样的问题。请问,支原体污染了就不能再做了吗?加环丙沙星养可以吗?会影响它的分化吗?请教各位前辈指点,谢谢!
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首先,原则上如果确认支原体污染,就直接放弃,如果是珍贵细胞,比如自己培育的细胞株,或者无法购买的,只能用杀菌剂试试看。
其次,支原体抗生素环丙沙星在临床是有效的,但喹诺酮类抗生素对细胞生长和分化到底有什么影响,我现在也不知道,有市售的专门针对细胞培养支原体污染的抗生素,我记不得厂家了,搜搜就知道,但是价格昂贵,差不多要1000多,所以,还不如买新的3T3L1了。
为了预防支原体污染,能不能预防用药?比如用低浓度的环丙沙星,是否能找个浓度对细胞影响最小?我现在正在做这方面的尝试,但这只是个人经验,不知道可否推广,因为具体情况实在太多的不同,总之,细胞房的环境要保持,然后,操作一定要细致,有结果再来汇报。
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