细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】3T3L1分化时飘了,越飘越多,分化不成功

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】3T3L1分化时飘了,越飘越多,分化不成功

xuuuu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118128
精华 1
积分 444
帖子 503
信誉分 102
可用分 3386
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-12-10
状态 离线
61
 

我也在做这个,分化不出来啊 求教 就是按接触抑制2天,诱导I(ibmx,ins,dex)2d,诱导II(ins)2d,后10d都没有看到明显的脂肪粒,有部分变圆了,但没有脂肪粒
顶部
雪花子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72953
精华 1
积分 259
帖子 194
信誉分 102
可用分 1776
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
62
 

目前,我已经毕业,实在是被伤到了,所以以后不再作科研了,估计也不会再养3T3L1,其实,这个细胞我刚拿到手的时候觉得还挺好养的,越到后来越知道难处啊。3T3L1培养和分化可能遇到的问题我只能尽我所知的总结如下:
1,分化不全,分化中细胞飘了;
2,一个假期回来细胞就变了,做不出来了;
3,有时候能分,有时候又不能分,分化率不能总控制的很好,实验重复不好;
这样的情况太多了,我个人觉得和整个实验平台有关。我遇到一个瑞士回来的博后,我跟她谈起我做3T3L1多么艰难的时候,她完全不能理解,觉得怎么会呢?她养3T3L1还能放双休,人家说3,4天换一次液没问题啊,当时我那个憋啊,这人和人差距怎么这么大啊……
废话不多说,在国内养3T3L1我的local建议:
1,首先考虑预算,老板有时候一拍脑袋就要做,他可能并没有细致思考要花那么多大米。
你要给他成本预算,3T3L1细胞株培养分化会比其他细胞基础培养贵很多,强烈建议全部使用protocol上的进口原单产品,例如sigma进口产品。包括常规DMEM,PBS,胰酶,全部要用原配的,而且永远不要随意改配方,用上好就一直用,要不然不知道怎么了,细胞就挂了。列个单子让老板看看,我当时大致算过,常规培养1瓶75cm细胞,每3天消化一次,种板,再分化,循环作业,一个月要数千以上。当然还不包括实验测试部分,比如去做cofocal啦,流式啦,WB等等啊,所以他要没这个底气,直接别做,要不然死定了。
2,如果作,细胞株的购买,我推荐北京协和细胞库,如果能直接从ATCC来当然更好。
如果细胞养着养着不分了,建议直接去协和再买一株,应该800元左右,成本最低的就是直接买。
3,考虑环境问题,我感觉国内细胞培养分化不成的关键问题是污染问题。
包括支原体污染,隐形细菌污染,或许还有重金属污染,液氮里污染更常见。WHO KNOWS???反正一切都不干净!为什么一过暑假细胞就挂啊,夏天,从液氮复苏,培养试剂放了一个假期……我后来都不敢放假,就怕回来不分了,真的很惨啊。
怎么办呢?说实话,不知道。双抗,或者再加上环丙沙星,起码有点保险吧。培养用品多高压灭菌,多消毒,决不重复使用二次。别的,操作就不说了,你要是粗线条的,分装直接拿瓶子倒的那种,那我就建议别作,真的,别作。
这个帖子时不时有人会看,会跟帖,好多同学遇到和我一样的困难,我只能说祝你们好运。要么坚持,要么及早掉头,加油吧。
顶部
SO2[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118006
精华 0
积分 355
帖子 369
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
63
 

楼主,我的细胞分化第3~4天飘起来好多,我离心之后再打回去隔天都死了,看来3T3-L1飘在培养基中不能存活。很桑心,现在一直找原因啊!您能不能给点建议呢?thanks a lot~ 试剂都是进口,严格按照规范操作。。。。
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
64
 
我已经从协和细胞库拿回来新的细胞株,但观察觉得状态一般,协和老师说这是复苏后第一代,所以可能需要再培养观察一下。
我已经传代,冻存了一些, 现在种了小皿,过几天就可以分化,看分化的效果,然后再来告诉大家,只有能分出来,才是好细胞。给大家看看这张图,是协和细胞拿过来传代后第2天的效果,感觉细胞不够丰满,有些细胞轮廓不清,状态一般。
希望和我一样在实验中遇到困难的人坚持到底!给自己打气!

......

==============================================================================================================

在网上查到的,生长良好的细胞,轮廓是不清的。
显微镜观察
生长良好的细胞,在显微镜喜爱可观察到细胞透明度大,折光性强,轮廓不清.相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构.若细胞生长状态不良,可见细胞轮廓增强,细胞折光性变弱,细胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质,细胞之间空隙增大,细胞形态不规则,甚至失去原有细胞的特点,产生园缩脱落,有时细胞表面及周围出现丝状絮状物
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
65
 
呵呵, 在我的体系里试剂应该不是问题,首先,我配的试剂曾经顺利分化达1年半之久,其次,我在今年分化出问题时所有试剂又重新配了一遍,都不成,试剂货号,配制方法全都不变。现在怀疑还是细胞出了问题。但出现问题之后,分析起来就是一个黑箱效应,只能从外面猜,看不到里面。现在仍在研究中,但结果未确定,等些时候我会再更新。
另外,协和的细胞不贵,700元一瓶。

=========================================================

我们实验室的细胞也是从协和买的。
最近实验进展不顺利,开始尝试用3T3L1做实验。
前脂肪细胞一直是用 DMEM低糖+10%CS 养。
细胞种6孔板后,长的很慢,3天了,还没长满,而且还飘了很多细胞。
愁死我了
顶部
vera+[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76438
精华 0
积分 506
帖子 711
信誉分 100
可用分 4361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
66
 
为什么我们做的3T3-L1的分化 细胞没什么变化呢 还是细长形 但是做了油红染色能染上颜色 可是就是形状没什么变化啊
顶部
eor[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117906
精华 0
积分 392
帖子 484
信誉分 100
可用分 3226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
67
 
我现在也在做这个细胞的分化,好烦人啊。。。
顶部
rfv[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117825
精华 0
积分 262
帖子 263
信誉分 100
可用分 2061
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
68
 
我现在也在做这个细胞的分化,好烦人啊。。。


查看积分策略说明
附件
2015-10-15 11:29
77000110.snap.jpg (273.66 KB)
 
2015-10-15 11:29
73115784.snap.jpg (282.96 KB)
 
2015-10-15 11:29
55537518.snap.jpg (271.61 KB)
 
2015-10-15 11:29
54106132.snap.jpg (226.31 KB)
 
顶部
rfv[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117825
精华 0
积分 262
帖子 263
信誉分 100
可用分 2061
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
69
 
请问这些是污染吗?
顶部
rfv[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117825
精华 0
积分 262
帖子 263
信誉分 100
可用分 2061
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
70
 

第一张是3t3-l1 诱导液2 加后第二天染色图片,后面几张是3t3-l1 未分化照片~
顶部