小中大测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)
问题1:上述公式中稀释倍数D是怎么算的(具体的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1?
问题2:我测的物质为毛发固体样品,二硫键含量在350μmol/g附近,此种测试方法是否具有可行性
问题3:由于毛发样品中含有非水溶性蛋白,又没哟测量二硫键含量的更好的方法