请各位大侠看看我提的RNA，能做RT吗？ - 经验共享

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标题:请各位大侠看看我提的RNA，能做RT吗？

豆荚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用1*TAE的1%普通琼脂糖电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下

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胶里什么其他的东西都不加吗？这样不担心RNA会降解吗？请指教。
如果这样真有效果我倒想试一试。

dior[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想你可以考虑一下再次提纯，纯化出纯度高的MRAN，你看呢？

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做rt的rna有如下要求:
18S和28S要清晰,且后者比前者亮.我感觉你的rna 不是很好,建议重提

大虾米[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以做，但你1、3孔好像有大分子物，象DNA。
我觉得你的RNA跑的挺好的。
试试吧。

橘子水儿[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不错，你的实验结果挺好，可以继续。：）
我提了RNA，鉴定也走电泳，1%普通胶，60-70V，10分钟左右观察。降解不明显。

金手指[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我建议不要做电泳的，因为你如果做得是rt-pcr，只需要用紫外分光度计测出rna的质量就可以了，这样决定了是否需要重新提取。。。。。。

join[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我认为降解的问题还在其次，在加样孔有DNA带，好像有DNA污染，如果你接下来做RT-PCR的话，就有问题了，到底是RT后的cDNA的扩增，还是基因组DNA的扩增呢？所以有必要加DNA酶处理，消除DNA。

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可以用的.
RNA提的好坏,基本标准:OD260/280比值1.8-2.0,2.0质量最高.电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1,如28S和18S的比值越小,说明RNA的降解程度越大,如28S和18S带消失,则意味着RNA完全降解,一定要弃之勿用,避免浪费.用1%普通胶,120-150v电用即可观察RNA的完整性情况,不一定非得使用1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳.
总之,高质量的RNA(完整性和纯度)是开展与RNA相关研究的前提和基础,一定要提好RNA!

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发表于 2011-9-20 13:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可以用的.
RNA提的好坏,基本标准:OD260/280比值1.8-2.0,2.0质量最高.电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1,如28S和18S的比值越小,说明RNA的降解程度越大,如28S和18S带消失,则意味着RNA完全降解,一定要弃之勿用,避免浪费.用1%普通胶,120-150v电用即可观察RNA的完整性情况,不一定非得使用1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳.
总之,高质量的RNA(完整性和纯度)是开展与RNA相关研究的前提和基础,一定要提好RNA!

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解释的很清楚阿,我们平常提RNA之后也是跑普通胶,但是无论是普通还是变性,电泳肯定是必须的.

回眸[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.

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请问您提到的0.5*TAE和1*TAE是什么意思，与跑dna 的TAE有何区别？

另外我最近做RT-PCR碰到的困难是：我早上造大鼠脑缺血模型，过12小时也就是晚上十点左右必须取材，我只能将取下的海马和皮层加入裂解液匀浆后
放到负70度冰箱，第二天早上来提RNA。紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,只有1.4-1.5,甚至会出现1.3-1.4。但浓度还行300-500ng/微升。

放在冰箱里是不是有影响，我应该注意些什么。

比值低但是浓度高，提示什么，这样的样本能做RT-PCR吗？

恳请指教！！！

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