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标题:引物间形成二聚体怎么办？

糊涂虫[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
考虑一下体系，包括你的引物浓度，dNTP浓度，DNA浓度，Mg++浓度，还有你的Taq酶，因为你问题的确很麻烦，必须好好优化体系，慢慢的一步一步来，不要怕麻烦，OK!
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三儿abc[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有一个问题：
在进行hotstart的时候，酶是最后才加的,加完了以后还需要混匀吗？
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
所谓的热启动，是将样品放于PCR仪中反应，待样品在94度充分变性后，再加入酶于样品中进行PCR。不是上面兄弟提到的酶要在９４度６－10min才能达到最佳酶活，这样做可以防止非特异的扩增并减少酶的失活！缺点是操作不如冷启动方便。无论什么时候，加样或者其他的操作，均相的反应效率最高，混匀是没有什么错误的。
如果PCR结果有引物二聚体形成，如果不严重，有目的条带，直接回收即可，没有必要追求一定很漂亮的扩增结果。
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还可以做套式PCR:
即在目的片段两端外面选择序列设计一对引物,这对引物因为没有位置的限制,可以设计的理想一点,扩增出比目的片段稍长的一段后,作为模板用楼主现在的引物来扩增,比直接扩更有效
再结合楼上各位老师的经验,应该会取得比较理想的结果
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飞天小鹿[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有用来计算引物之间相互作用的软件啊，哪位指点一下
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发表于 2011-9-20 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用QIAGEN的hotstar 没有这么麻烦，冰上将样本和酶混合后，直接上PCR仪，循环前95度15分激活酶。不用先加热样本，再加酶。
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爱哭鬼[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位：
问一下，如果有引物二聚物，可以测序吗？
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不懂[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看您的引物二聚物的量。很少量的是可以测出来的，但是结果不太好,；二聚物多了，只能测出来引物！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用QIAGEN的hotstar 没有这么麻烦，冰上将样本和酶混合后，直接上PCR仪，循环前95度15分激活酶。不用先加热样本，再加酶。

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问一下：如何在冰上混呢？
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笔笔[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看您的引物二聚物的量。很少量的是可以测出来的，但是结果不太好,；二聚物多了，只能测出来引物！

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测序前的纯化没有用么?  
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