食品分析者

参考的方法如下：
取1mL在2.3.3.6中配制的豆浆溶液加入2.0mL的缓冲液1（每升溶液含10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2g EDTA，pH=8.0）或缓冲液2（每升溶液含10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2g EDTA，480g尿素，pH=8.0）后再加入0.02mL的Ellman试剂（0.2gDTNB溶于50ml缓冲溶液1中），25℃下保温5min，采用可见分光光度计，在412nm处测定吸光值。实验以不加豆浆，而加Ellman试剂为空白。巯基含量的测定= 73.53*A412*D/C  , 式中A412为有DTNB存在时豆浆的吸光值减去无DTNB存在时豆浆的吸光值，D为稀释倍数，C为豆浆固形物含量
   这是一篇文献中测定巯基的方法，我也是按这个过程操作的，在计算过程中A412（有DTNB存在时豆浆的吸光值减去无DTNB存在时豆浆的吸光值）出现了负值，不知道有么有人知道可能是什么问题造成的呢，该怎样处理这个问题，而且已经重复做了试验，确定不是操作失误，会出现三四个负值，请问方法有什么可能存在的问题吗？求大神解答啊

建议做个波长扫描，看一下有DTNB存在时豆浆的最大吸收波长是不是412nm，和无DTNB存在时豆浆在412nm处的吸光度

今天下去去测了，确实是412，因为实验需要不同温度热处理，在热处理过程中有几个值出现负数了。。。

为什么有的实验中，A412直接为加了DTNB的吸光度，有的是加与不加的差值？

我有两次，也出现负值，用的标准曲线法

测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下：
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度（mg/mL）
问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？
问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性
问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法