食品分析者

我要测定面团当中的自由巯基含量。用的Ellman方法（蛋白质提取后加入DTNB显色反应，测412nm吸光度）。
这是我的操作。
按照国标方法清洗面筋，然后冷冻干燥，磨粉过筛后制备得到面筋蛋白粉末。
用10ml  8M尿素-Tris/Hcl溶液 溶解0.1g面筋，磁力搅拌1h。
10000g离心10min，取上清液1 ml 加入4ml 8M尿素-Tris/Hcl，100ul 4mg/ml DTNB.
然后就没有颜色反应。
面筋蛋白溶液加巯基乙醇和盐酸胍处理之后，用三氯乙酸沉淀蛋白，结果盐酸胍晶体析出，导致后来不加盐酸胍了（这个问题又是闹哪样！）。沉淀后的蛋白质用8M尿素溶解加DTNB有颜色反应，说明方法没问题，二硫键也存在的好好地。

问题出在哪里呢？我用半胱氨酸溶液和DTNB反应，有颜色反应，说明DTNB没问题。自由巯基容易被氧化，是在制备面筋蛋白的过程中被氧化了？还是有其他什么原因呢。我看很多中文文章都测过，很容易的样子，可是我一直没搞定。

处理液Tris/HCl pH问题，显色液可能要用Tris/Gly-SDS-Urea ,另外Ellman试剂也使用Tris/Gly 配，显色时间、水浴温度等，你都没提到？

tris/Hcl （1L里溶解20.4gtris，6.9gglycine，1.2gEDTA） pH 8.0，ellman以及其他试剂都用的这个tris/Hcl 配置的。
显色液我用的8M尿素溶液（溶解在tris/hcl ，没有SDS）。
显色5min。（发现没颜色，一直放着，也都没颜色）
没有水浴，室温放置的。

你是参考国标的么？ Ellman试剂不用tris/HCl 配，应该用tris/gly 配。而针对面筋蛋白的处理液（一般是tris-gly-edta-urea 之类的）最好参考权威文献。另外，若是测蛋白中总巯基一般需要40℃水浴15min-25min充分显色。  最关键我觉得是你离心后上清液中水溶蛋白到底有没有；若有，巯基有没有充分暴露而与DTNB反应。 楼主再好好看看参考文献，理清溶液配置的一些细节，重点看看面筋蛋白相关密切的内容。

没有测巯基的国标吧？至少没找到。
我看中文用ellman方法的全部是这么做的（然后就假设中文没那么可信）
参考外文，《determination of SH- and SS-group in some food proteins using ellman's reagent》. 我也一开始很怀疑离心后上清中没有蛋白，后来加三氯乙酸沉淀上清中的蛋白质，确实有沉淀，说明上清里是有蛋白质的。只不过，用尿素提取，能溶解多少

测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下：
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度（mg/mL）
问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？
问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性
问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法