小中大按照文献方法来处理,但回收率怎么也上不去
大家好,我使用OASIS HLB 3cc/60mg 小柱来做血清中PBDEs,严格按照文献方法来处理,但回收率怎么也上不去,备受煎熬啊!具体方法:
1、加标:10mL离心管中加入200uL正己烷,加入10uL的PBDE混标(100ppb),氮气吹干,加入200uL丙酮,涡旋1min,加入2mL血清,涡旋1min,超声20min,4℃平衡过夜;
2、蛋白变性:取出血清恢复至室温,加入2mL甲酸-乙腈(2:1)混合溶液,涡旋1min,超声20min,再加入2mL水稀释,准备上样;
3、固相萃取:小柱先用3mL二氯甲烷淋洗除杂,抽干柱床;再用3mL甲醇和3mL水活化;保持柱床湿润,上样,每次上样1mL,流速为3秒/滴,再用0.5mL甲酸-乙腈-水(2:1:3)溶液润洗离心管两次;用3mL5%甲醇的水溶液淋洗,2000r离心10min,抽真空30min使柱床干燥;分别用4mL和8mL二氯甲烷洗脱;
4、硅胶柱净化:用6mL空柱管自制层析硅胶柱,从下到上:1cm无水硫酸钠-1.5cm酸性硅胶-0.5cm中性硅胶-1cm无水硫酸钠;固相萃取洗脱液氮吹浓缩至干,用0.5mL正己烷复溶,上样,管子用0.5mL×2正己烷润洗;用6mL正己烷-二氯甲烷(1:1)洗脱,氮吹浓缩,转移至样品瓶,定容至40uL,进样分析。
以上是全部的前处理步骤,实在不知是哪些地方不正确导致了样品的损失,回收率离80%还有好远啊,实验压力已经非常大了,请求哪位高人帮我指点迷津,十分感谢!