小中大最上层是否是纯正己烷，胆固醇是否溶于其中？
最近打算测定巨噬细胞内的胆固醇，由于细胞量较少，因此考虑用LC-APCI-MS进行测定，但是在提取胆固醇时遇到了较大的问题，请诸位高手指教。
我考察的提取方法：
1，细胞生理盐水洗两遍，1ml生理盐水中刮下，超声裂解破碎。
2-1，对于总胆固醇，160ul裂解液中加入300ul的15%KOH（乙醇溶液），震荡至澄清。
2-2，对于游离胆固醇，160ul裂解液中加入300ul的 8.9mM KOH（乙醇溶液），80℃水浴1h。
3，二者皆加入等体积的异丙醇：正己烷（v/v 1:4），震荡30s进行进行萃取，萃取产物800g离心5min，取上清入新管
4，使用异丙醇：正己烷（v/v 1:4）重复萃取共三次，合并上清液，真空减压干燥
存在问题：
主要问题存在于总胆固醇的提取步骤，第一次加入萃取溶剂460ul后，震荡分层共三层，上清液不足300ul，中层浑浊，最下层澄清不足100ul。
再次加入300ul萃取溶剂，震荡分层所得上清不足200ul，最下层量增加，中间层仍浑浊。
再次加入500ul萃取溶剂，只有两层，最下层澄清，以及上层整体浑浊。
另外，游离胆固醇的提取若按照上述方法，所得上清也会越来越少
想请教：
1、最上层是否是纯正己烷，胆固醇是否溶于其中？中层的浑浊是KOH的盐沉淀，还是蛋白。大量的KOH溶解在哪？
2、我的操作是否有明显问题，大家有没有成熟的方法可以分享，最好能附参考文献，感激不尽！
