mRNA直接PCR能扩增出产物吗？ - 经验共享

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标题:mRNA直接PCR能扩增出产物吗？

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-20 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问题
同一个-cDNA在一些引物对时无扩增现象而在某些引物对是有扩增现象。
所有引物设计都是符合上游和下游引物分别位于不同外显子，这样可以确保不会扩增Genomic DNA。
而如果有逆转录酶的少少量污染，那么对于所有引物对，一般都应该有扩增产物，而我做GAPDH或CYCLOPHILIN时，-cDNA结果是阴性的，这说明其中不含cDNA。因此不是含有DNase消化了可能污染的cDNA而使结果变阴性的。
所以还是觉得奇怪。
但是我看到一篇文献似乎提到这种可能，可是作者未写明，只是DATA NOT SHOWN，我准备发EMAIL再详细问一下。
不过希望大家对此讨论或者哪个有条件可以做一下看看。
如有兴趣我可以提供引物序列。

椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

怀疑是个好习惯，但作了假设后就要仔细求证^_^

跨内含子设计的引物依然可能从genomic DNA中扩增出与cDNA为模板大小相仿的带来。假基因（pseudogene）的存在就是原因之一。注意，假基因可以不含内含子的。概念见：cuturl('http://binfo.ym.edu.tw/post/genome/pseudo_gene.htm')

正确的做法是用RNase free的DNase处理总RNA, 设立处理与未处理、加RT 酶与不加RT酶的对照实验。

实验应当具有可重复性，若仅仅是偶然的结果，就不能轻下结论^_^

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这很有意思。从RNA到DNA是质变，而PCR过程只是量变，这里面必须要有一个因素来使之达到飞跃，就是逆转录酶。要知道PCR反应中的DNA聚合酶是只认得DNA模板的，没有RT过程提供第一条DNA，扩增无从谈起。你要是想在PCR过程中用一个只认得RNA模板的DNA聚合酶，那也有问题，因为总是只有母体的一条RNA做模板，无法形成双链，也没有办法大量扩增。除非找到一个同时认得RNA模板和DNA模板的聚合酶（当然还得符合PCR过程的苛刻条件），但这个过程如果聚合酶以RNA为模板合成了DNA, 其实也还是一个质变的问题，就是逆转录。

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Tth DNA Polymerase 在Mn 2+存在时显示RTase活性。但此酶合成的cDNA平均长度只1-2Kb，而且催化反应的最适温度较高，不合适用oligo(dT)或random Primer，Mn 2+的存在也会降低DNA合成的保真度。

岸上的鱼[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我好像看过国外的一个文献，TAQ酶也具有逆转录酶样作用，但是将RNA直接放入PCR体系中进行PCR的实验我没做过，如果按照RT-PCR两步法条件，全部用taq酶完成，说不定可以出带，方便的同仁可试试。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的两位兄弟或者哪位XDJM能找到这些文献吗，我想看看，近来对此问题觉得非常有趣。
此外：piscean wrote
Tth DNA Polymerase 在Mn 2+存在时显示RTase活性。但此酶合成的cDNA平均长度只1-2Kb，而且催化反应的最适温度较高，不合适用oligo(dT)或random Primer
虽然oligo(dT)或random Primer不适合，但是据说提RNA时混合一些小片段的DNA，他们仍然可能作为引物的。而且1-2kb长度足够可以作为PCR模板，因为我的PCR产物才100bp上下
对于TAQ这是最常用的酶

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

此外：piscean wrote
Tth DNA Polymerase 在Mn 2+存在时显示RTase活性。但此酶合成的cDNA平均长度只1-2Kb，而且催化反应的最适温度较高，不合适用oligo(dT)或random Primer
虽然oligo(dT)或random Primer不适合，但是据说提RNA时混合一些小片段的DNA，他们仍然可能作为引物的。而且1-2kb长度足够可以作为PCR模板，因为我的PCR产物才100bp上下
对于TAQ这是最常用的酶

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Tth DNA Polymerase并非Taq，而且其RTase活性也只有在Mn 2+而非Mg 2+存在时才能得已表现，而之所以说不合适用oligo(dT)或random Primer是因为Tth 要求的温度较高，不利于这类引物的退火，当然如果你并不想要全长cDNA或你的目的片断较小的话可以考虑用Tth，尤其是作定量RT-PCR的话减少中间步骤还可以使结果更可靠!但你可能要设计较高Tm值的引物。还有一个问题，Mn 2+存在时Tth的保真度很低。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

EVIDENCES
找到相关文献,Taq Polymerase在68度左右确实具有RTase活性
下面是文献,请大家继续探讨
1.Nucleic Acids Res. 1989 Oct 25;17(20):8387-8.
Reverse transcription of mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase.
Jones MD, Foulkes NS.
网上无全文摘要,请自查原文期刊,或者求助管藏
2.J Biochemistry and Mol Biol 2002; 35(2):248-250
A simple method for elimination of false positive results in RT-PCR.
Martel F, Grundemann D, Schomig E.
关于Tth和Mn离子有关,也有文献
Biochemistry 1991. 30(31):7661-6
Reserse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase.
Myers TW and Gelfand DH.

花裙子[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不可以，如果你的经费不足的话，可以用总RNA直接反转录，再做PCR。这样的条件刚做过，只是在加总RNA时量要增加，效果还不错，我的结果已送去测序。

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问一句，您的意思，如果经费足的话，可以如何做？

请指点

小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2011-9-20 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR是用双链做模板的，这个是不变的基本原理。直接用单链RNA是不能做PCR的，必须要转录成双链。 RT-PCR也是要合成了双链DNA之后才能PCR的。看看这个RT-PCR的图解就知道了。