食品分析者

测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下：
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度（mg/mL）

请教各位大神，这种方法中稀释倍数（D）和样品浓度（C）是多少？怎么得出的？万分感谢！！！！

样品浓度C=样品的量（15mg）/溶液体积（5ml）=3mg/ml

稀释倍数D是自己定的，根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后，反应后测定得到的吸光值比较合适（一般0.2-0.8）。

如果按样品浓度3mg/ml正好合适，就不用稀释，即稀释倍数即为1是吗？

是的。如果初始浓度合适，稀释倍数即为1。

我想问一下你怎么测的二硫键，那个NTSB配的太麻烦了，有没有什么好的办法？

有，就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂，在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键，然后在Native page gel上可以看到不同的band，从而定量。