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标题:求助“关于石蜡组织DNA的提取”

紫圃[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在已经用上述的办法提取了一些石蜡组织的DNA，琼脂糖电泳检测DNA的量还很多，但是我却怎么也P不出我的目的条带，今天又做了一次，还是没有条带，只是出现一片亮带，而且用内参GLOBIN也做不出来，是不是石蜡组织的DNA在固定等因素下变的更复杂？
有经验的老大教教小妹一把把吧？
万分感谢！！！！
我的反应体系和条件是：
10X PCR buffe　　　2.5µL
　　10mMdNTP 　0.5µL
50µM上游引物　　　0.5µL
　　 50µM下游引物　　　0.5µL
　　DNA Taq酶（2.5u/µL) 0.5µL
　　DNA模板　　　　　　5µL
加水至25µL
条件： 1. 95°C　　　　5min 1cyc
2 .95°C 30s 35cyc
　 60°C 45s
　 72°C 1min
3. 72°C 7min 1cyc
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米囡[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是石蜡切片，用蛋白酶k消化后灭活了直接做PCR，可以做出阳性条带。和你的不一样。你是石蜡切片，所以可能DNA要多得多。
你的PCR如果模板太多，结果也会没有条带。既然你已经测过DNA的量了，就要掌握好模板用量，少一点没有关系，太多了反而出不来哦。你最好带一个阳性对照，排除PCR模板以外的问题。
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们科室里有人用别的石蜡组织提DNA做P53的引物，和你的方法一样，不纯化DNA，效果还好，可是我却做不出来，你说我的模板浓度太高了吗？我的电泳结果是一片亮带，没有目标带，这和模板量有关吗？还有你有没有测过你的模板量，用琼脂糖跑胶用多少DNA？
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你问到上海瑞金医院有待消化的组织量的问题我下次帮你问
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紫圃[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能不能再问一下石蜡组织DNA做PCR要注意什么问题？
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做这个是不测的，也不可能测啊，因为没有提取嘛。但是比如血的DNA我是会测一下DNA量的。而且我也不跑电泳，做PCR对模板的要求并不高。
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紫圃[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在抽提石蜡组织DNA时，琼脂糖电泳检测DNA的量时发现我提的基因组DNA呈一条亮带，而且位置大约在溴酚兰之前，我用这样的DNA却怎么也P不出我的目的带（229bp），结果只是呈一片亮带，是不是我的DNA在抽提时机械损伤太大呢，把DNA都切割成小片断了，才会出现这种情况呢？我该怎样避免呢？
或者我还有哪里做错了呢？
恳请你们的建议！！
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有一个问题是你的石蜡组织固定剂和你们科已经做出来的是一种固定剂固定的吗？要知道含有升汞和苦味酸的福尔马林固定剂会将核酸降解，这样的组织是肯定做不出PCR的！你为什么不先用切片直接做PCR试一试呢？  
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紫圃[使用道具]
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发表于 2011-9-20 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"你为什么不先用切片直接做PCR试一试呢？ "

你是说我不要纯化，直接用粗制品做PCR 吗？
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紫圃[使用道具]
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 小中大
"你为什么不先用切片直接做PCR试一试呢？ "

你是说我不要纯化，直接用粗制品做PCR 吗？
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