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将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。
4.3 转移
剪两个小的滤纸片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE胶面的一端。然后,将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。
4.4 跑胶
浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时
5. 银染(两根胶条所用剂量)(银染特别注意用超纯水)
5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超纯水定容至500ml
5.2 敏化 30min 无水乙醇 150ml
Na2S2O3•5H2O 1.5688g
无水乙酸钠 34g
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3 洗涤 5min × 3次
5.4 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml
5.5 洗涤 1min × 2次
5.6 显影 无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml
甲醛(37%)0.1ml, 临时加
5.7 终止 10min EDTA—Na2•2H2O 7.3g 用超纯水定容至500ml
5.8 洗涤 5min × 3次
注:整个双向电泳实验中全部使用超纯水,尽量减少离子的影响。
B. 实验相关试剂配制
1. Bradford 工作液
95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷
85%磷酸 52ml 酸,最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶
考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存(Bradford不稳定,一周内有效)
2. 裂解液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4%
DTT 60 mM
Tris—base 40 mM(如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate)
3. 水化液储液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4%
Tris—base 40 mM
4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml
SDS 0.4% 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g
5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml
SDS 0.4% 0.4g
Tris—HCl 0.5M 6.07g
6. 凝胶储存液(30%的丙烯酰胺) 250ml
Acr 29.2% 73g
Bis 0.8% 2g
7. 电极缓冲液(跑一次要配制2500ml)
甘氨酸 43.2g 36g
Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml
8. 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液
6.1g Tris先用30ml超纯水溶解,再用46ml,3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml
9. 平衡液储液