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标题:为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度

喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最大的问题在于：

你的序列中的碱基组成很不均匀（具体见附图分析），连续的G或C很多见，所以虽然平均的GC含量为55%左右，但局部的GC含量有的甚至高达80%,所以常规的PCR很难奏效。

建议使用高GC扩增条件。比如可以使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增。



最好看看其他文献是否有直接通过PCR扩增出该片段的，和作者直接联系一下。
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只有使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增局部GC含量高的片段这一种办法吗？

有没有其他办法？土土的问：例如巢式PCR可以的吗？
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只有使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增局部GC含量高的片段这一种办法吗？

有没有其他办法？土土的问：例如巢式PCR可以的吗？

============================

1。扩增高GC含量的方法可能有其他。
2。巢式PCR解决的不是这个问题。
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在PCR体系中加入DMSO是可以降低GC比例的，还有其他的办法吗？？
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你上面分析产物GC比的软件是什么呀？
谢谢！
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ffooll[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢各位。
把退火温度降到50度，得到的片段在700多。？
还没找到扩增整个tk基因的文献。
我想试试TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增的方法。
再谢。  
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议：
1。模板处理：要得到完整的模板，纯度要达到要求。这是要扩增到2kb基因的前提。
2.反应体系：要合适。一般教科书上的反应体系，扩增2kb应该没有问题。
3.可以用高保真的聚合酶。也可以用一些公司的试剂盒如：华美公司的5Kb高保真试剂盒。
知觉上，你的第二对引物要好一些。
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=菓子=[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
试过MBI的pfu酶和NEB的vent，结果跟普通的Taq差不多。
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=菓子=[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TAKARA的 LA TAQ酶with 2XGC BUFFER试过了，没有产物。
郁闷～～  
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森林木[使用道具]
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发表于 2011-9-22 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
反应系统有没有问题？
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