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标题:提取组织样品中的病毒DNA

小蜜蜂[使用道具]
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发表于 2011-9-24 08:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有哦，听说反复冻融是不好的。
我对PCR可是真正的菜鸟，说的不对别介意哦！
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mod=8048[使用道具]
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发表于 2011-9-24 08:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好,先试试
因为病料是可疑病料,采了很久了,没有做确诊,所以不好进行病料的筛选,只有全部拿来做了.
反复冻融主要是破坏细胞壁,释放病毒粒子,当然对病毒会有一定损伤,但应该不会影响PCR吧.我乃菜鸟也哦!
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
反复冻融主要是释放病毒粒子，增加病毒粒子的含量。但是不会对接下来的试验有影响，因为我们就是想获得病毒的DNA或是RNA，不破坏怎能释放出来呢。
沉淀病毒，除了用超离外，可以用PEG沉淀法分离病毒粒子，我觉得比超离省事还简单，不妨可以试试。
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小蜜蜂[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
反复冻融主要是释放病毒粒子，增加病毒粒子的含量……

是这样的呀！
可能我看的资料太老了；（
再去问问我老师……
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问PEG沉淀法怎麽做,需要配的试剂好象比较多是吗?
使用于大量组织样品中病毒DNA的提取吗?
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问PEG沉淀法怎麽做,需要配的试剂好象比较多是吗?
使用于大量组织样品中病毒DNA的提取吗?
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小葵[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PEG沉淀法分离病毒粒子并不需要很多试剂，操作还是比较容易的，我做的主要是针对细胞，获得病毒粒子，具体方法如下：
PEG溶液配制：30％聚乙二醇6000-8000，1.2M NaCl，过虑
操作步骤：1、250g 4℃下离心悬浮细胞10min，将悬浮物转移至一新离心管。
对于贴壁细胞，最初离心步骤可省略。
2、8000g 4℃下离心悬浮物10min。
3、将悬浮物转移至新离心管，每2ml悬浮物中加1mlPEG溶液，充分混合，于冰上孵育过夜。
4、8000g 4℃下离心10min。
5、弃掉悬浮物，仔细吸弃残余PEG溶液，
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小葵[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PEG沉淀法分离病毒粒子并不需要很多试剂，操作还是比较容易的，我做的主要是针对细胞，获得病毒粒子，具体方法如下：
PEG溶液配制：30％聚乙二醇6000-8000，1.2M NaCl，过虑
操作步骤：1、250g 4℃下离心悬浮细胞10min，将悬浮物转移至一新离心管。
对于贴壁细胞，最初离心步骤可省略。
2、8000g 4℃下离心悬浮物10min。
3、将悬浮物转移至新离心管，每2ml悬浮物中加1mlPEG溶液，充分混合，于冰上孵育过夜。
4、8000g 4℃下离心10min。
5、弃掉悬浮物，仔细吸弃残余PEG溶液，然后在进行下面的提取操作即可。

我做的量比较小，但若量大，就按比例相应扩大呗。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-24 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常谢谢两位的帮助,我今天就去翻一下书,配试剂
昨晚睡觉前我又想了个办法,研磨组织,然后反复冻融,先低速然后超速离心,沉淀病毒离子,然后再提取,是不是可以节约试剂呢?
请教一下!!有没有可行性!

==============================================

这个方法我用过，去年做禽流感时用的，我们的具体方法是：
1.拍击式均质器粉碎组织，取反复冻融的组织液和血水
2.10000rpm离心去处组织碎片和其他杂质
3.3.5万rpm 4h离心沉淀病毒
4.提取病毒RNA
5.定量PCR

结果很好
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发表于 2011-9-24 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
组织碎片和杂质，你用于提取病毒了吗？
还是只提取了3.5万rpm的病毒沉淀
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