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标题:【求助】PCR反应体系

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发表于 2015-11-7 11:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR反应体系


PCR反应体系中为什么有的加入二甲基亚砜?它能起到什么作用?
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发表于 2015-11-7 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 join 于 2015-11-7 11:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PCR反应体系中为什么有的加入二甲基亚砜?它能起到什么作用?

一般的PCR体系中不需要加入二甲基亚砜，但是有些PCR反应体系中加入二甲基亚砜，它作为一种辅助成分可以提高反应的特异性和产量。故又称为PCR反应的增强剂。
类似的辅助成分还有甘油、甲酰胺、牛血清白蛋白、PEG-6000等。
其加入量为：
甘油5-20%，
二甲基亚砜1-10%，
甲酰胺1.25-10%，
牛血清白蛋白10-100ug/ml，
PEG-6000 5-15%。
而且，有时候运用常规PCR扩增体系难以获得特异性产物，只有在有这些增强剂存在时才能扩增成功。
譬如说：当引物的G+C含量很高时，常规的PCR体系难以获得特异性产物，只有通过添加二甲基亚砜等PCR反应的增强剂才能成功的扩增出所需要的产物！！！！
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发表于 2015-11-7 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢楼上 我所做的实验PCR产物应该是两条条带,一条是对照条带320BP,另一条是特异性条带240BP. 可是我做了一周,结果只出现了对照产物,而没有出现特异性产物.而文献上写到PCR反应产物出现对照产物320BP时,说明反应体系适宜.请问楼上我的实验结果不好,它与我的反应体系中未加二甲基亚砜有关系吗?望回复.谢谢!
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发表于 2015-11-7 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这很难说哦！因为你的体系并没有给出来。
既然你是按照文献上做的，你可以加二甲基亚砜后跑一次，看有没有。如果还没有的话再考虑其它原因！
还有一种可能就是因为你的对照条带320BP,另一条是特异性条带240BP，它们在胶上可能根本就没有分开。
如果你的对照条带和特异性条带是在一管中跑的PCR的话，采用2％的胶，跑的时间加长，看有没有可能把它们分开。
如果你的对照条带和特异性条带不是在一管中跑的PCR，而是分开跑的，只是电泳时上样在一个点样孔中，那么可以重新跑次电泳，将目的条带和特异条带分开点样，这样也能判断目的条带出来没有！
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发表于 2015-11-7 11:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢楼上,我想应该在电泳上跑开了,因为我在点样时加了MARKER.100BP为间隔的.100-600BP这六条带都出来了.但就是没有240BP的条带.下面附上我的PCR反应体系,望楼上能帮我指导指导.谢谢!!!
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 小中大
相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病先天性卵巢发育不全综合征

我是学内分泌专业的,我的课题题目为<<PAI-1基因4G/5G多态性与糖尿病合并肾病的相关性研究>>.现在正在做PCR实验阶段，实验结果不理想。只有对照引物出现了条带，而4G和 5G引物没有出现条带。引物是根据文献合成的， 上游对照引物 Tm 值是61.99；GC%是46.15； 共同下游引物Tm值是66.00;GC%是70.00; 缺失型等位基因(4G)特异性引物Tm值是59.42;GC%是64.71; 插入型等位基因(5G)特异性引物Tm是61.83;GC%是70.59. 对照产物是320BP的，4G和5G的产物是240BP的.试了几天在Tm =67时出现需要的对照产物，并且条带亮度还可以.但是没出现4G和5G的产物.而且文献中写到出现对照产物320BP时,说明PCR反应体系最适宜.请楼上能帮忙分析一下，不胜感激！
我的PCR体系： 模板DNA2μl,上游对照引物 0.3μl
共同下游引物 0.3μl,4G特异型引物0.3μl ,5G特异型引物0.3μl.(以上引物浓度为25UMOL/L)
Taq酶 0.2U
Taq buffer 2.5μl,MgCl2 1.3μl
DNTPs0.2μl
加水至25μl
94ºc 3m
94ºc 45s
67ºc 45s
72ºc 1m
35 cycles
72ºc 3m
郁闷中，急！
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 小中大
我的反应退火温度也用过58度的,引物也各加量到0.4UL.可是仍然没有特异性的反应产物,请您帮我分析一下.
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发表于 2015-11-7 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

路过，随便说说：我也做过不少PCR，可是dNTP加的是你的十倍的量（2ul）。不知你的dNTP浓度是多少。
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 小中大

我的dNTP浓度是10mmol/l,我今天下午又做实验了.同时还加了ACE基因的上.下游引物作对照,结果是ACE反应产物490BP的条带出来了 ,可是PAI-1基因的条带还是没有出来.在两个反应体系中除了引物的量不一样,其他的量都是一样的 .不是是哪里的问题?还望能给予指点.谢谢!
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 小中大

1. 如果你的反应体系是参照文献来做的，那最好也要加入二甲基亚砜，因为引物中G+C含量比较高，可能只有加入二甲基亚砜才能跑出目的基因。
2. 反应体系中引物的量和dNTP的量也是完全按照文献来做的吗？
个人认为下游共同引物的量不够，而且确实如楼上所说，你的dNTP的浓度未知，所以不知道你的dNTP量够不够 。
3. 根据你的反应体系，你应该是跑的共管PCR，在没有跑出目的基因前，可现将各个目的基因与参照基因分开跑，等跑出目的基因后再寻找两者共同的适宜温度跑共管PCR。
4. 我们的反应体系如下，以供参考：
cDNA 3.0 µl为模板，依次加入去离子水 16.3µl，10×buffer 2.5µl，25mmol/L MgCl2 1.5µl，上游引物20µmol/L 0.5µl，下游引物20µmol/L 0.5µl，10 mmol/L dNTP 0.5µl，Taq酶（5u/µl）0.2µl构建25µl PCR反应体系。
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