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标题:【求助】PCR反应体系

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发表于 2015-11-7 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正如楼上所说 1.我确实把下游引物加倍过,可是结果形成了大量的引物二聚体,还是没有特异性条带. 2.有的文献上也没加二甲基亚砜,我想应该能出来结果吧 3.我也曾经分管做了两次,可是同样出来引物二聚体,不知到底是啥原因? 4.至于底物的量 ,我加了0.2UL,出来过对照条带.文献上是0.5UL,您说与它有关系吗?有人专门做过底物梯度的实验,说是底物量大也不行.特请您帮忙参考,谢谢!!!
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发表于 2015-11-7 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然以上这些你都注意过了.。
那就只有先单独跑目的条带，做一个退火温度的梯度。譬如说4G 的Tm 为59度，那就从54度开始，每2度跑一个梯度，直到跑出目的条带为止。大部分时候实际退火温度比提供的低，但是有些时候实际退火温度会比提供的高一些。所以具体的温度还是要通过梯度摸索！！
总之一句话，在没有单独跑出目的条带之前，最好不要跑共管PCR。免得既浪费了时间，又浪费了金钱。
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发表于 2015-11-7 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我帮你大体看了一下文献，
既然你的阳性对照能跑出来，证明你的模板、试剂应该都没有问题。
根据你的文献，在同一个样本中，4G和5G至少能跑出一个来，但是不能确定你手上现有的标本能跑出4G还是5G，所以只能够同时摸索退火温度。
建议：
用同一个样本的模板跑5管4G，5管5G，不要加内参照。另外再单独跑一管内参照作为此次的对照。内参的温度就按你以前跑的温度。共11管。
4G/5G的退火温度选择：60、62、64、66、68。
采用以下体系：
DNA 3.0 µl为模板，依次加入去离子水 16.3µl，
10×buffer 2.5µl，
25mmol/L MgCl2 1.5µl，
上游引物20µmol/L 0.5µl，
下游引物20µmol/L 0.5µl，
10 mmol/L dNTP 0.5µl，
Taq酶（5u/µl）0.2µl
构建25µl PCR反应体系
跑完后用1.5%的琼脂糖电泳，当指示剂跑过胶的一半时再看胶。
等你的好消息！！
PS：再给你个建议，可以使用天为时代的2×Taq MasterMix 混合体系跑PCR，只要再加入模板和引物即可，可减少操作误差，简化操作步骤！
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发表于 2015-11-7 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那我4G/5G分别应该加多少呢?望指教.那您的意思是我总共做十五次PCR吗?因为我们这里PCR仪不能按温度梯度运行.望赐教!谢谢!!!
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发表于 2015-11-7 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你是怎么算出 15 次来的？
既然你那里没有梯度PCR仪，就分5次跑。不过这5次要使用同样的DNA模板，和试剂！！
第一次跑两管，一管只加 4G 的引物，另一管只加 5G 的引物。
退火温度设置为 60 度。其它的按照给你的体系加！！
至于引物的量，按照给你的浓度
上游引物20µmol/L 0.5µl，
下游引物20µmol/L 0.5µl，
换算。
另外四次也是每次跑两管，和第一次一样，只有退火温度不同，其它条件都是一样。第二次跑62度，第三次64，一直到第五次的68度。
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发表于 2015-11-7 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先说出我的肺腑之言,真得非常非常感谢您!!!能得到您的指点,我感到万分荣幸!因为这个课题纯粹是我自己查资料,自己定课题,自己做实验......我的导师是纯粹搞行政的;再者,我特别想把这个课题做成功,每天4G/5G反应产物都会出现在我的睡梦中,我不想放弃!万般无奈!我只有求助大家了.再次对帮助过我的人表示由衷的感谢!!! 其次,我想请教您一下,您说的一管只加4G引物,是什么意思呢?是不是在其中加入4G引物,共同下游引物,DNA模板,DNTP,酶,缓冲液,镁离子,去离子水只至体系达25UL?另一管就是把4G换成5G,其他一样,是这样的吗? 望赐教!谢谢!!!
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发表于 2015-11-7 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢您的及时回复!我今天又做实验了.每个标本分两管做,一个是4G管,另一个是5G管. 反应体系具体如下:上游引物0.3UL,共同下游引物0.3UL,4G引物0.3UL,(引物浓度为25UM/L),DNTP0.4UL,酶0.3,镁离子1.3UL,缓冲液2.5UL,加水至25UL;5G反应管加量与4G管一样. 实验结果:对照产物320BP条带特别好,实验老师说,这样的条带连20BP的间距都能分开.但是就是没有特异性条带. 并且前面还有剩余的引物,不知为何? 郁闷啊!!!望赐教
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发表于 2015-11-7 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 join 于 2015-11-7 11:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢您的及时回复!我今天又做实验了.每个标本分两管做,一个是4G管,另一个是5G管. 反应体系具体如下:上游引物0.3UL,共同下游引物0.3UL,4G引物0.3UL,(引物浓度为25UM/L),DNTP0.4UL,酶0.3,镁离子1.3UL,缓冲液2.5UL,加 ...

为什么还会有对照产物出来，不是叫你不要加对照产物的引物么？？？？
你加的引物中：上游引物0.3UL,共同下游引物0.3UL,4G引物0.3UL 上游引物是什么的上游引物？？？？？不是叫你在反应体系中只加4G的上游引物和共同的下游引物么？？
还有，你用的4G的上游引物的序列是什么？？？能给出来么？
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发表于 2015-11-7 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦 今天上午没来得及照您指点的去做,打算明天再按您说的去做.望见谅! 引物序列为： 插入型等位基因（5G）特异性引物：5＇-GTCTGGACACGTGGGGG-3＇， 缺失型等位基因（4G）特异性引物：5＇-GTCTGGACACGTGGGGA-3＇， 共同的下游引物：5＇-GCTGTCCACCCGGTGCTCTG-3＇， 上游对照引物：5＇-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3＇。 此引物序列来自昨日给您发的参考文献.
谢谢!!!
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发表于 2015-11-7 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先我要在此感谢白白的老师,在他的热情帮助下,我今天终于做出了实验应有的结果,结束了近半个月的噩梦般的生涯.这种心情是无法用语言来形容的!由衷地说一句话!太谢谢您了!!!(不管你年龄有多大).是您给了我在黑暗中勇往直前的信心!!!我一定会把您的精神发扬下去!!!
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