【求助】PCR反应体系 - 经验共享

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标题:【求助】PCR反应体系

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发表于 2015-11-7 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天按照您的吩咐分管做了,并且把退火温度调到62度,结果特异性条带出来了.今天没加上游对照引物,等我明天再分管加一个上游对照引物,等结果出来,我给您看看电泳结果.来共同享受一下咱们的努力结果!谢谢!!!

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发表于 2015-11-7 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2015-11-7 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请你有空看看我的今天实验的反应体系: 首先加入去离子水16.5UL,10成的缓冲液2.5UL,25UM/L镁离子1.5UL,下游引物25UM/L0.4UL,4G引物25UM/L0.4UL,10MM/LDNTP0.4UL,TAQE0.3UL.最后加入模板DNA3UL.总体系达25UL.其他5G.上游对照引物的加量与4G反应管一样. 请你帮我分析一下,是什么原因导致出现那么多的杂带?并且我该去如何改进呢?谢谢!

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发表于 2015-11-7 11:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好!我已给你把电泳结果发到你的邮箱里,请你抽空过目. 在电泳图中第一条条带为MARKER,其他每三条为一个标本,依次类推,共做了三个标本.其中在标本的三条条带中第一条检测4G基因,第二条检测5G基因,第三条是上游对照.今天用的退火温度仍为62度.希望您能给予宝贵意见!争取做出最满意的实验结果!!!谢谢!!!

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刚刚看了你的电泳图（如下），内参照和4G的温度已经比较稳定了，但是5G的条带不稳定，第一个和第二个样本杂带比较多，但是第三个样本的5G 条带很好。
建议：
用62度重新跑一次第一和第二样本的5G ，如果还是没有稳定的目的条带，那就单独跑一个5G 的退火温度梯度（从60～68），比较一下那个温度条带最清楚！
至于下面的引物二聚体，暂时不要管他，等5G的退火温度稳定了之后在调整！
另：以后可以直接将电泳图贴到帖子上，也方便其它战友帮你出主意！！！
如何贴图请见：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=111&id=1399406&sty=1&tpg=1&age=0')
你的电泳图：