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标题:【求助】ployA加尾法PCR U6引物加什么？

dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 11:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 hyuu 于 2015-11-7 11:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我也要做miRNA的染料法荧光定量，也打算用takara的试剂盒，但是对有些东西还不够了解，想请教一下。
1.逆转录时需要设计miRNA的茎环引物吗?看你上面的回复，好像用polyA法似乎不用合成茎环引物啊。用的是通用引物吗？
2. ...

1、有通用引物
2、对
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misswu61[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
5'端修饰一下呗 这么短的序列 没有什么好的办法，PCR的条件苛刻一点了 说不定特异性会好一点，我也注意到你说的这些情况，但是没有管他，直接去跑了 ，没有想象中的糟糕，都还可以，有些有杂带的就估计是引物不好的原因（下面那个，考虑就是引物的原因，结果就不可靠了）


。
......

==============================================================================================================

一开始设计的时候我直接用的miRNA成熟序列，没有考虑Tm值，二聚体，GC含量这些问题，但是后来跑出来不太好，后来问了公司说是设计的问题，另外我做的是血浆，不知道样本是不是也有很大的影响因素，现在在用组织做，希望会有好结果~~谢谢你的答复~~
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

U6还是加的特异性引物才能跑出来么，还是只加了上游引物?
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wawa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只加上游
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发表于 2015-11-7 14:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加通用引物，应该能跑出来。你的上下游引物Tm值平衡了吗？TaKaRa的通用引物Tm好像是65°C吧，会是你的U6正向引物和通用引物形成二聚体了吗？
话说，你用特异下游引物应该也可以吧，也就是个内参，保持每孔一致就可以了吧？
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发表于 2015-11-7 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加通用引物，应该能跑出来。你的上下游引物Tm值平衡了吗？TaKaRa的通用引物Tm好像是65°C吧，会是你的U6正向引物和通用引物形成二聚体了吗？
话说，你用特异下游引物应该也可以吧，也就是个内参，保持每孔一致就可以了吧？

===================================

嗯 后面用别人的内参做了 就可以了 谢谢
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发表于 2015-11-7 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dotaaa 于 2015-11-7 14:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
加通用引物，应该能跑出来。你的上下游引物Tm值平衡了吗？TaKaRa的通用引物Tm好像是65°C吧，会是你的U6正向引物和通用引物形成二聚体了吗？
话说，你用特异下游引物应该也可以吧，也就是个内参，保持每孔一致就可以了吧？

======== ...

麻烦前辈告知一下你用的内参上游引物序列吧，我今天用了一个U6上游跑了一下也是出现双峰。
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我自己的跑的也不好，你看楼上提供的是否可用

=========================================

U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG
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8s5g[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，请问上游引物的修饰是两端都可以吗？是只能删减还是可以适当增加一些碱基序列？可以增加的话是在哪一端？因为有些Mir序列里面GC比太低或者太高了。从文献上查到的一些上游引物序列的TM值只有53℃，但是通用的下游引物却是60℃，那反应的延伸温度没有关系吗？麻烦你了m(_ _)m
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，请问上游引物的修饰是两端都可以吗？是只能删减还是可以适当增加一些碱基序列？可以增加的话是在哪一端？因为有些Mir序列里面GC比太低或者太高了。从文献上查到的一些上游引物序列的TM值只有53℃，但是通用的下游引物却是60℃，那反应的延伸温度没有关系吗？麻烦你了m(_ _)m

====================================

5'端修饰，可以先跑一下看 ，一般跑的出来
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