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标题:【求助】ployA加尾法PCR U6引物加什么？

8s5g[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dotaaa 于 2015-11-7 14:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，请问上游引物的修饰是两端都可以吗？是只能删减还是可以适当增加一些碱基序列？可以增加的话是在哪一端？因为有些Mir序列里面GC比太低或者太高了。从文献上查到的一些上游引物序列的TM值只有53℃，但是通用的下游引物却 ...

不好意思，最近没上来逛园子。请问正向引物设计以后要怎么放去BLAST？之前的时候没有考虑到这个问题。常规的BLAST方法验证不了。如果只是把正向引物放进mir序列的比对的话结果惨不忍睹
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summerxx[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
嗯 后面用别人的内参做了 就可以了 谢谢

===========================================================

请问，您后面是用U6的上下游特异性引物做的吗？还是只加了上游引物？
如果是上下游特异性引物，在反转录的时候应该加U6的特异性RT引物吗?
谢谢
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summerxx[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG

==============================================================================================

您是用加尾法吗？反转的时候是用通用引物，还是R Primer？ 跑realtime 的时候是加F和R primer吗，还是F 和通用引物？
谢谢
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 summerxx 于 2015-11-7 14:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG

...

加尾法逆转录的，跑的定量 ，反向是通用引物，由试剂盒提供了
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发表于 2015-11-7 14:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加尾法逆转录的，跑的定量 ，反向是通用引物，由试剂盒提供了

==============================================

那您的U6的F Primer是自己设计的吗？还是从公司买的？
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发表于 2015-11-7 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那您的U6的F Primer是自己设计的吗？还是从公司买的？

=============

自己设计
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moonlight[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也和你一样 不过我后来用的是U6的FR 没有用试剂盒的 可以跑出来 如果用试剂盒的通用引物好像跑的不好诶。你是否能给出你修饰之后的U6F序列参考一下？
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也和你一样 不过我后来用的是U6的FR 没有用试剂盒的 可以跑出来 如果用试剂盒的通用引物好像跑的不好诶。你是否能给出你修饰之后的U6F序列参考一下？

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自从梁上君子光临我们寝室一次以后 我所有的东西都被他带走了，往后的问题回答不了了
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加尾法只加上游引物，下游用通用的。不过加尾法的u6和茎环的u6是不一样的，有现在成的商品化的，直接买来用就行了。
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 whitesheep 于 2015-11-7 14:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

加尾法只加上游引物，下游用通用的。不过加尾法的u6和茎环的u6是不一样的，有现在成的商品化的，直接买来用就行了。

是的 谢谢。顺便请教一下战友。普通PCR的内参引物 长度270bp 用来做荧光定量PCR（染料法）的内参 测出CT值13~14 而我的母的基因CT值都是25~29 40个循环，这样的数据可以用吗？
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