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标题:【求助】定制好的引物如何处理？新：如何充分溶解？

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发表于 2015-11-7 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】定制好的引物如何处理？新：如何充分溶解？

因为是第一次做PCR，老板不管啊，Angry
所以拿到送来的引物，不知如何处理好！分别为2 OD和4 OD值，做PCR时估计用50微升量，终浓度大概为0.2~1.0umol/L,请教我该用多少水稀释，应该注意什么？？？？我算了以下估计用500微升稀释就行，但是第一次做，想征求大家意见！！谢谢
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duchy[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

送来的引物上面都有该怎样稀释的说明吧。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物先加灭菌水 200 ul， 37 oC 30 min， 没隔几分钟 vortex， 使其充分溶解。
然后取部分稀释 30 倍，测OD260，OD 值×0.033×稀释倍数就等于你引物的浓度了（ug/ul），再调制成10 uM 的浓度，50 ul的总反应体系里加2 ul就可以了。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加水要根据说明书，一般根据引物的分子量决定加多少水，计算公式在说明书上，一般稀释后浓度为100uM，作为储存液，使用液要稀释5倍，在根据你的反应体系决定加多少。
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泡泡[使用道具]
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发表于 2015-11-7 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
送你个公式
摩尔数(ug)=(OD值*33)/(330*碱基数)
终浓度100umol/L=摩尔数/X
X就是你所要加的水体积了
当然说明书上的会更精确,这里会有些误差,但不会差太多
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发表于 2015-11-7 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说明书上有具体的nmol数和OD值
是不是引物必须有储存液储存（高浓度），用时再稀释？为什么？直接稀释到20umol/L储存 不行吗？急于寻求解答！！Question
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发表于 2015-11-7 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

低浓度更容易降解
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发表于 2015-11-7 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

sorry 啊，上面有一个地方打错了，储存液浓度是50uM,换算是1OD=33ug，用你的OD值*33，然后除以你引物的分子量，用此数再除50，换算后就是你所需要加的水量了。
高浓度易于保存，总不能买一次引物，存一大堆使用液吧，另外也如楼上，使用液稀释5倍。
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发表于 2015-11-7 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好用TE溶解以便长期保存。你知道了nmol数， 直接加TE溶解就行。 浓度根据你自己的需要来定。 一般储存液浓度高比较好，比如100pmol/ul。
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发表于 2015-11-7 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再问个问题：引物DNA容易溶解吗？具体应该如何做比较好啊？毕竟好多票票啊！
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