小中大限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的PCR仪。这
种方法 简单便宜,但并不能完成抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增
。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq
DNA聚合 酶,在反应体系达到90度时,PAUSE,将温度保持在70度以上,手工加入polymer
ase,但这个方法 过于烦琐, 尤其是对高通量应用,并容易造成污染。其他的热启动方法
使用蜡防护层将一种基本 成分,入镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓
冲液,物理地隔离开。在热循环时, 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很
多公司提供这样的酶。
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ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
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象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。
还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活,当变性温度
超过70度时,抗体也变性了,这样polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是
引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很
难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个 booster PCR 我一直找
不到合适的词来翻译这个booster.
具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molar ratio
在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平
8. 循环数和长度
确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环
数容易造 成ERRORS和非特异性产物的积累 产物的量不够, 优化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循环数
如何确定循环数,有一个方法.
做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析
.从而确定最佳的循环数
另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然
是越高 越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地
9. thermal cycler
PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的
温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学
因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配,
增加产物的长度和产量.
在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另
一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定, 而提高了
扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结
合gradient pcr选择最优条件.