PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】qPCR碰到的几个问题（带图表）

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 32  1/4 1234››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】qPCR碰到的几个问题（带图表）

JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1

发表于 2015-11-10 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】qPCR碰到的几个问题（带图表）


最近做realtime-PCR，刚起步，碰到一些问题还不懂如何分析，把图贴出来请大家多多指点，谢谢！
用的是：Biorad IQ5机器，Sybr green 染料
第一个问题：结果其中有三个样本的扩增曲线明显不同（红色圈圈标出的），请问这种现象如何解释？


查看积分策略说明
附件
2015-11-10 10:46
37449876.snap.jpg (25.86 KB)
 
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2

发表于 2015-11-10 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这三个曲线对应的熔点曲线如下图（红色圈圈的三条曲线对应上面的三条曲线），是不是因为引物二聚体引起？


查看积分策略说明
附件
2015-11-10 10:46
69166885.jpg (30.03 KB)
 
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3

发表于 2015-11-10 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个问题出在哪个步骤上？样本的问题还是program的问题？
请大家多多指导，有些基础的东西可能都没有弄懂，
所以请大家讲得越基础越好，谢谢～～！


查看积分策略说明
附件
2015-11-10 10:46
14492831.jpg (39.43 KB)
 
顶部
xingyi08[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76899
精华 0
积分 496
帖子 671
信誉分 100
可用分 4201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
4

发表于 2015-11-10 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

什么基因？溶解曲线峰值不是一个吧。
那三个是什么样品？扩增效率明显跟别的不一样。
起始模板浓度可有摸索？
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2015-11-10 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是每个样品做三个well，一共测12个gene，这三个曲线的样品都不同，是不是可能加样的时候出现了问题？
模板浓度按以前经验做的，是否应该调整？
谢谢！
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
6

发表于 2015-11-10 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上朋友，我是刚开始接触realtime-PCR，所以有些地方不一定很清楚，某些“中级战友”是虚有其名的，呵呵
1. 我还是没有明白你要用qPCR做什么？为什么是12个基因？普通PCR也没有这么做的吧。基因不同，引物不同，起始浓度不同，你放一锅里用同一个程序扩增？目的呢？
我用realtimePCR测定实验组小鼠较正常对照组mRNA表达水平的改变，选12个基因是因为实验需要，每次只能做96个孔，每个基因测三次。目的是看实验组相对于正常对照基因表达水平的相对倍数改变情况（升高或降低）。因为不少基因的realtime扩增程序都基本相近，所以我就偷懒一起做了，相信很多朋友做realtime都不是每次只做一个基因吧？
2. 按经验？按什么经验？我的经验是先做普通PCR摸条件，起始浓度在摸定量标线的时候也可以摸一下。起始浓度会影响扩增效率和特异性。
经验是别人做这些基因的经验。我跑PCR的cycles和qPCR的差很多，因此我不用普通PCR摸的条件。
请多多指教！
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
7

发表于 2015-11-10 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
one legend
顶部
xuuuu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118128
精华 1
积分 444
帖子 503
信誉分 102
可用分 3386
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-12-10
状态 离线
8

发表于 2015-11-10 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主加样的时候不觉的累吗，我一次做30个标本就已经很累了，楼主的精神值得我学习Smile
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
9

发表于 2015-11-10 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
one gene, one primer pair, one batch, one standard curve, and one amplification efficiency!
I have never seen anynone ampilfy more than one gene using qPCR under the same condition but you! we have 6 or 7 PhD students working with qPCR, but nobody does it like that. laziness?Smile

====================================================================================

我没有做绝对定量，用qPCR做相对定量，利用deltadelta公式计算，难道大家做相对定量也是一次一个基因？
很多引物的扩增条件都相近，应该可以一次完成吧？我知道这个比较偷懒，还请就其弊端讲得详细点。
非常感谢！
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
10

发表于 2015-11-10 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xuuuu 于 2015-11-10 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主加样的时候不觉的累吗，我一次做30个标本就已经很累了，楼主的精神值得我学习Smile

一般样品准备1-2个小时，但是如果分开做，岂不是更累，还要花更多时间？
顶部
 32  1/4 1234››