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标题:【求助】realtime PCR 加样

hyuu[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】realtime PCR 加样


各位老师，我做realtime PCR时，总是加样不准确，重复孔间误差很大，不知道大家加样时有什么技巧可以使加样误差小点呢？谢谢！
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ending[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将必须单独加的东西单加，其余的都配好混合以后在分加到各管中。
由于很多情况下我多做几个基因的，所以加样时一般都是模板和引物单加，其余混合后再加，每次加样时都仔细看看枪头中是否有残留，如果有就尽量弄进去，如果不行，就仍了重新加。
另外最好选择50ul体系，反应体系大一点可以降低一些加样误差。
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yizhi[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的建议也正是我要说的。只有这样才可以保证减低复孔之间的误差。
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发表于 2015-11-10 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用进口枪头加样吧，残留比较少
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yizhi[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

进口枪头也会存在残留问题。只要能保证每次残留一样，也可以啊。：）
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PCR[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

进口枪头也会存在残留问题。只要能保证每次残留一样，也可以啊。：）
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u234[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议用AXYGEN的枪头加样，和国产的枪头价格相差不大，有些国产枪头清洁质量不能保证，容易残留，最好枪头都已经灭菌。
最好选择一把合适的枪，首先保证你使枪的本领过关。
一般我是加好mix后，最后加cDNA，重复三复孔，如果非常重要的标本，可以用四复孔。
离心转数可以加到3000rpm 2min，这样离心比较彻底。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把模板和引物等都加到96孔板后，上PCR之间还要不要震荡和离心呢？
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toy[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我之前用的是八联管 但是现在订的是96孔板，订回来后才发现实验室没有96孔板的离心机，我想问一下要是加完样后不离心，可以吗 ？谢谢
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wood533[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

八联管和96孔板加好样后最好先在震荡器上震一下再离心，这样可以充分混匀使曲线更加平滑。如果不想震荡和离心，在配体系时（除样本以外的其他成分）一定要充分混匀，再分别加到96孔板里，加入样本时要吹打，注意不要有气泡和残留，也不能沾到管壁上，这需要手法熟练啊。
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