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标题:【求助】怎么在NCBI上查我想要的目的基因？

mimili_901[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎么在NCBI上查我想要的目的基因？


我是个新手，过些天要做RT-PCR,我把关于原理和方法的理论知识学习了一下，有一些了解了。但是不会设计引物，我只知道先要在NCBI上查到目的基因，然后用引物设计软件设计，也可以在线设计，但是我还是不知道具体该怎么做。比如说我打开NCBI网页后，不知道该怎么找，引物操作软件也不知怎么操作。另外，还有一个地方不明白：需要先把mRNA转化成cDNA，然后用cDNA再做PCR,那么前面那一步是不是也要设计一个引物呢？是不是做一个逆转录PCR要设计两个引物呢？
恳请各位高手具体的告诉我怎么做。非常感谢您的热心和耐心！
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

查询基因的方面就是输入你需要查询的基因的英文名称以及宿主，然后在前面的一个框内选择nucleodices，就可以查询到很多这个基因的相关序列，再搜索与你目的相符的基因。点击前面的GenBank登录号就可以看见更为详细的描述以及DNA序列，当然需要注意的是你需要的是基因组序列呢？还是CDS或者蛋白质序列。
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物设计建议用primer5.0设计就好，下载你的目的基因的CDS序列，然后保存为FASTA格式。具体设计原则与操作方法我就不再详细叙述，请搜索论坛里面有关primer5.0操作手册以及引物设计相关注意事项。
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好！再麻烦您一下：我想设计NIH小鼠IFN-γ受体（IFN-γR）的引物。我根据您的指点在NCBI上输入了IFN-γR mouse ,并在前面框内选择了nucleodices，出来的搜索结果如附件。我还是不会看输出的结果，不知道怎么就得出我要的目的基因了，能不能再给具体指点一下啊。能不能帮我查一下，列出来。我的这方面底子薄，谢谢您的耐心帮助！
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idea2011[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
逆转录引物分三种，olig dT ,随机引物和特异引物。前两种试剂盒里会有，不需要自己设计，
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duchy[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我和楼主有一样的困惑,还请 战友一并解答一下,如果要设计某基因的反义ODN,又该如何操作?
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我帮你找了一下有关鼠属的IFN-γ受体基因的CDS序列，下面贴上的序列就是你所需要，请查看！
M26711. Reports Murine interferon...[gi:194126]   Links
* Comment
* Features
* Sequence
LOCUS MUSIFNGX 2085 bp mRNA linear ROD 12-JUN-1993
DEFINITION Murine interferon-gamma receptor (IFN-gamma) mRNA, complete cds.
ACCESSION M26711
VERSION M26711.1 GI:194126
KEYWORDS gamma-interferon receptor.
SOURCE Mus musculus (house mouse)
ORGANISM Mus musculus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia;
Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Mus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 2085)
AUTHORS Gray,P.W., Leong,S., Fennie,E.H., Farrar,M.A., Pingel,J.T.,
Fernandez-Luna,J. and Schreiber,R.D.
TITLE Cloning and expression of the cDNA for the murine interferon gamma
receptor
JOURNAL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (21), 8497-8501 (1989)
PUBMED 2530582
COMMENT Original source text: Murine T-cell hybridoma, cDNA to mRNA, clone
mgr.
Draft entry and computer readable copy of sequence [1] kindly
provided by Fennie,E.H., 09-AUG-1989.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..2085
/organism="Mus musculus"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:10090"
CDS 106..1539
/note="interferon-gamma receptor"
/codon_start=1
/protein_id="AAA37896.1"
/db_xref="GI:309330"
/translation="MGPQAAAGRMILLVVLMLSAKVGSGALTSTEDPEPPSVPVPTNV
LIKSYNLNPVVCWEYQNMSQTPIFTVQVKVYSGSWTDSCTNISDHCCNIYEQIMYPDV
SAWARVKAKVGQKESDYARSKEFLMCLKGKVGPPGLEIRRKKEEQLSVLVFHPEVVVN
GESQGTMFGDGSTCYTFDYTVYVEHNRSGEILHTKHTVEKEECNETLCELNISVSTLD
SRYCISVDGISSFWQVRTEKSKDVCIPPFHDDRKDSIWILVVAPLTVFTVVILVFAYW
YTKKNSFKRKSIMLPKSLLSVVKSATLETKPESKYSLVTPHQPAVLESETVICEEPLS
TVTAPDSPEAAEQEELSKETKALEAGGSTSAMTPDSPPTPTQRRSFSLLSSNQSGPCS
LTAYHSRNGSDSGLVGSGSSISDLESLPNNNSETKMAEHDPPPVRKAPMASGYDKPHM
LVDVLVDVGGKESLMGYRLTGEAQELS"
sig_peptide 106..180
/note="interferon-gamma signal peptide"
mat_peptide 181..1536
/product="interferon-gamma"
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ORIGIN
1 cggcaggccg cttgcggact tggcgactag tctgcggcgg acgtgacgcc aaggccaggc
61 cacgggcagc gcgggtcccc tgtcagaggt gtccctcgcg caggaatggg cccgcaggcg
121 gcagctggca ggatgattct gctggtggtc ctgatgctgt ctgcgaaggt cgggagtgga
181 gctttgacga gcactgagga tcctgagcct ccctcggtgc ctgtaccgac gaatgttcta
241 attaagtctt ataacttgaa ccctgtcgta tgctgggaat accagaacat gtcacagact
301 cctattttta ctgtacaggt aaaggtgtat tcgggttcct ggactgattc ctgcaccaac
361 atttctgatc attgttgtaa tatctatgaa caaattatgt atcctgatgt atctgcctgg
421 gccagagtta aagctaaggt tggacaaaaa gaatctgact atgcacggtc aaaagagttc
481 cttatgtgcc taaagggaaa ggtcgggccc cctggcctgg agatcaggag gaagaaggaa
541 gaacagctct ccgtcctcgt atttcaccct gaagtcgttg tgaatggaga gagccaggga
601 accatgtttg gtgacgggag cacctgttac acattcgact atactgtgta tgtggagcat
661 aaccggagtg gggagatcct acatacgaaa catacggtcg aaaaagaaga gtgtaatgag
721 actctgtgtg agttaaacat ctcagtatcc acactggatt ccagatattg tatttcagta
781 gacggaatct catctttctg gcaagttaga acagaaaaat cgaaagacgt ctgtatccct
841 cctttccatg atgacagaaa ggattcaatt tggattctgg tggttgctcc tcttaccgtc
901 tttacagtag ttatcctggt atttgcgtat tggtatacta agaagaattc attcaagaga
961 aaaagcataa tgttacctaa gtccttgctc tctgtggtaa aaagtgccac gttagagaca
1021 aaacctgaat cgaagtattc acttgtcaca ccgcaccagc cagctgtcct agagagtgag
1081 acggtgatct gtgaagagcc cctgtccaca gtgacagctc cagacagccc cgaagcagca
1141 gaacaggaag aactttcaaa agaaacaaag gctctggagg ctggaggaag cacgtctgcc
1201 atgaccccag acagccctcc aactccgaca caaagacgca gcttttccct gttaagtagt
1261 aaccagtcag gcccttgtag cctcaccgcc tatcactccc gaaacggctc tgacagtggc
1321 ctcgtgggat cgggcagctc catatcggac ttggaatctc tcccaaacaa caactcagaa
1381 acaaagatgg cagagcacga ccctccaccc gtgagaaagg cccccatggc ctccggttat
1441 gacaaaccgc acatgttggt ggacgtgctt gtggatgttg gggggaagga gtctctcatg
1501 gggtatagac tcacaggaga ggcccaggag ctgtcctaag gtctcccgag gcctgctggt
1561 ggtaaagaaa ctgacctttt aggcagtttt tctgcattga tttcatgaaa gaagctatac
1621 attagctaat actaaccaca tagaatatca gacttagata cgtgaataag gatcctgtgg
1681 gcactgctgg gtccactctg caaatgccaa gactatcaaa ggaacgtatt gtcgcttctg
1741 gctccttccc aggtgggcta gcatctgtga gtttgcctcg gctagccttg cttcctacag
1801 ccgccactgc tcctccaccc tgatcatctc acaggacagg gtggaccggg tttttttttt
1861 tttcacacac ctttgtatat gtaagttcat gtatataata tgtttacatg tttcactttg
1921 aactgaaagc tactcaaagc cagccgtaag tctatggtag aatgtgatgg aacatgttgg
1981 tggaagcttg tacaatagaa cacattggtg ggagcttgta catacttttt tatggagcat
2041 tacttacgat tttttaagta aaatgttttg aaaccaaaaa aaaaa
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u234[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 查找序列： 楼主去ncbi上查查这个序列，一般来说选一个年代比较近的mRNA序列。
2 设计引物： 根据mRNA序列设计引物，注意产物的大小、是否跨内含子问题，并且不同的反转录引物，pcr时引物设计的位置是有要求的，楼主多注意查找相关信息。
3 一般来说，反转录的时候把Oligo 和Random一同加入的话，可以不必考虑引物设计的位置问题。
4 反转录时也可以加入特异性下游引物。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2015-11-10 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回答楼上的逆转录问题：就是你将老鼠组织的mRNA提取出来后，用现成的反转录试剂盒反转录出cDNA 后（这一步不需要设计引物，你直接购买现成的试剂盒就可以反转录出你所需要的全长cDNA了），根据上一楼我给你找出的IFN-γ受体基因的CDS序列设计引物，该基因的CDS序列是从 106bp到1539bp处，引物设计时需要落在这个区间。
回答lvygwyt战友的问题：关于设计某基因的反义ODN问题，这个实验我没有做过，不过给你提供一些建议。首先，反义ODN其实本质上与反义RNA干扰技术是一样的，一般设计反义ODN的长度为75-200bp为宜，至于这个反义ODN的区间你可以选择落在其功能区域上，以便于后续做荧光定量PCR时候可以估算其抑制效果。
建议实验步骤如下：
1、找到你的目的基因序列，如果没有，则采用设计引物进行同源基因PCR的方法将其扩增出来，然后进行双向测序确保无误后再根据得到的序列进行反义ODN的设计。如果是基因组序列，可以用软件来进行预测其CDS序列。
2、提取靶基因的mRNA反转录成cDNA后，用设计好的反义ODN引物进行扩增，连接到适宜载体上。
3、转染后检测目的基因是否已转入受体中，可用PCR的方法检测，相关实验方法请参考园中的方法
4、可设计引物进行荧光定量PCR目的基因的表达量，同时请提取受体细胞的总蛋白进行2D电泳，以便于检测其蛋白表达量的变化，当然，这两个实验必须以没有转染过的同样的受体细胞作为对照，同时请用转染后，检测反义ODN存在的情况下不同时间梯度的抑制情况。
以上仅供参考，如有疑问，欢迎互相交流！
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