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标题:【求助】如何证明是否mRNA反转录cDNA第一链成功

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发表于 2015-11-10 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何证明是否mRNA反转录cDNA第一链成功


突然想到这个问题，否则从何而知以第一链为摸板扩增时一旦没有产物，是第一链摸板的问题，还是PCR体系的问题：
因为总RNA里的mRNA成分很少，那么反转录出来的就更少了，我用的是promega的盒子。昨天自己想了两个办法，但是都没有实现
1，想用GENE QUANT，根据260，280OD的比值来确定，可是由于cDNA含量很少，所以结果不理想，分光光度计的方法误差比较大，说明不了问题
2，把含有cDNA的mixture跑1%琼脂溏，但是不知道什么原因，跑出来的结果是白板。本来我还以为回出现一些蛛丝马迹，但是却很失望。
另外我想问的是，我跑的白板，可不可能是因为cDNA的含量太少了，所以EB染色看不出来呢？各位的经验是什么？
小弟才从事这个操作，望各位大侠指点
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、RT第一链是通常是不能用电泳来检测的，原因是量太少，常常检测不到。
2、你所扩增的片段的大小是不是太长，如果太长，通常是不容易扩增出来的，这种情况下你需要多试一些扩增条件，有时不能完全按照试剂盒的说明书做。
3、你用的试剂盒是不是适合你分扩增的片段，你可以看看文献，看别人用的什么试剂盒，你可以借鉴，当然，我说的是去看外文的大杂志上的文章。
4、如果实在不行，你还可以分开做，先做RT，再做PCR，这个办法不是万能的，但有时还是不错的。
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发表于 2015-11-10 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 vvmmoy 于 2015-11-10 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、RT第一链是通常是不能用电泳来检测的，原因是量太少，常常检测不到。
2、你所扩增的片段的大小是不是太长，如果太长，通常是不容易扩增出来的，这种情况下你需要多试一些扩增条件，有时不能完全按照试剂盒的说明书做。
3、你 ...

多谢回答
我还想继续问一下：
先做RT，再做PCR？我那个试剂合也是这样的啊，否则应该怎么做？
就是应该分两步的吧
请指点
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发表于 2015-11-10 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有两个方法：
1、用内参；
2、如果有已知以此模板扩出来的，可以用此引物验证。
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发表于 2015-11-10 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的,一般来说,mRNA提出后跑电泳出现了三条带,内参也p出后,也就说明cDNA没问题了,我以前也试着拿cDNA拿去跑电泳,结果是一片smear,不过很多pcr书籍文献上都没有提及过用电泳来检测cDNA,也就说明这种方法不可取吧,个人见解,呵呵!
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发表于 2015-11-10 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

理论上，cDNA是长短不一的DNA片断，所以电泳的结果是模糊一片的，但是如果mRNA丰度低，电泳也可能是无产物，但是这种情况也不代表PCR无结果。
检测cDNA一般可以用内参，内参有结果，cDNA的质量基本上可以保证（少数情况下－－如目的基因bp过长－－可能例外）。
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 小中大


QUOTE:
原帖由 社会主义好 于 2015-11-10 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是的,一般来说,mRNA提出后跑电泳出现了三条带,内参也p出后,也就说明cDNA没问题了,我以前也试着拿cDNA拿去跑电泳,结果是一片smear,不过很多pcr书籍文献上都没有提及过用电泳来检测cDNA,也就说明这种方法不可取吧,个 ...

的确，cDNA电泳就是这个样子的！
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发表于 2015-11-10 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

理论上，cDNA是长短不一的DNA片断，所以电泳的结果是模糊一片的，但是如果mRNA丰度低，电泳也可能是无产物，但是这种情况也不代表PCR无结果。
支持内参法,很科学.
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发表于 2015-11-10 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢各位的回答
再问一个弱问题：
为什么会分出三个带，28S，18S，5S？
对于其中的原理，我不是很明白。
请指点，呵呵，谢谢拉
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-11-10 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能问一下“内参“与对照是不是一回事？
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