【求助】PCR无目的条带只有引物二聚体，如何解决？

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标题:【求助】PCR无目的条带只有引物二聚体，如何解决？

wiwi[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物Tm值是58度，扩增目的条带217bp,分别在退火温度55度和57度跑PCR，内参条带很清楚，可是没有目的条带，而是引物二聚体，我该怎么办？再提高退火温度还是降低退火温度，请高手指教啊，十万火急！谢谢！

whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分析一下你的引物有没有问题

caihong[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
如果引物没有问题,建议做一个退火温度在45-55度之间的梯度PCR.

wiwi[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物是用Primer Premier 5.00 设计的，评分100。

jude[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议用oligo再分析一下引物,看3'端有没有二聚体,如果引物二聚体条带很亮的话,那肯定是引物与引物之间进行配对阔增了,根本就没有与模板结合,因为如果退火温度不合适,会有杂带出现,那么温度再提高1到2度就可以减少或消除杂带,如果只有引物二聚体,那就再进行一下优化,把退火温度再降低一两度看看,还有就是要做一下阳性对照,也就是换一套体系看看pcr反映体系中是不是有些成分失活了,还有模板,,最好把模板再跑一下电泳看一下有没有降解掉,如果这些情况都没问题,那就只能是引物问题了,另外,如果你的引物二聚体条带很亮,那肯定是引物问题

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发表于 2015-11-10 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教一下模版电泳是怎么跑法啊?

bojitu[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

和PCR 产物一样琼脂糖跑了

nn255[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR扩增不出现目的条带常需考虑以下原因：
1. 模板
1）模板中含有杂蛋白质；
2）模板中含有Taq酶抑制剂；
3）模板中蛋白质没有消除尽；
4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；
5）模板核酸变性不彻底。
2.酶失活
需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶活性丧失或不够引起。
3.引物
要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应该大体一致。如亮度不一，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融。引物长度不够或引物之间形成二聚体也会影响结果。
4.Mg离子浓度
浓度过高可降低PCR扩增的特异性，过低则会使Taq酶不稳定。要详细阅读Taq酶的说明书。一般浓度为1.5-2.0mM。
5.反应体积
并非等倍增加相应反应物即可得到相似结果。
6.物理原因
变性温度低，时间短会增加非特异性扩增。变性温度过高，时间长会影响Taq酶的活性。需要阅读Taq说明书，标准条件为95℃，5min。
7.靶序列变异
另外尚需考虑是否加样时漏加Taq酶。
内参条带清楚的话，考虑模板降解的可能性较小。
建议把引物原液跑琼脂糖凝胶电泳先。

wiwi[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果引物没有问题,建议做一个退火温度在45-55度之间的梯度PCR.
请问作梯度PCR有什么意义？

cocacola[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
引物有无问题主要包括一下几个方面:
1. 去NCBI比对引物得特异性
2.用oligo分析引物得特性,例如是否形成二聚体等
3.合成问题,哈,这个只有找个好得合成公司了,不能只管合成价格啊.
梯度pcr得意义:
梯度pcr是用来摸索pcr时得最佳得退火温度得,因为无论是公司得合成订单还是软件给出得引物得Tm值都是一个参考值,毕竟关于Tm值有3中算法.理论上退火温度是比Tm值低5-10度,从此也可以看出退火温度需要摸索.
和qiaozengpei前辈不同得建议是建议做45-60得梯度!

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