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标题:【求助】RT-PCR实验求助

hold住[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】RT-PCR实验求助


RT-PCR实验求助，急！
请教各位高手：
我需要从人的外周血中提取单个核细胞，抽提总RNA做RT-PCR检 测单核细胞表面某受体的mRNA表达水平，我拟用ficoll分离液，请教最少需多少血量？我想搜集一批标本后再做，应如何保存血标本以后再做才不会影响结果？能否-20度或-80度全血直接保存？？？
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
贫血
一般3—5ml就可以了，但要看病人的情况了，如果有血液系统疾病如贫血可能需血量多一点。
全血不可以直接冻存，因为如果象你这样保存血标本以后再做会溶血，影响结果。
若要保存一批标本，可以先提出RNA再转录成cDNA再置于-20或-70度保存。
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发表于 2015-11-10 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢楼上的指教，请教如取血标本后不能马上处理提取总RNA，是否会影响结果？有无什么好办法？
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发表于 2015-11-10 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你用何种方法提取总RNA。千万不能全血冻存，可以在分离出单个核细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。我以前用TRIZOL试剂提取总RNA，此法可将TRIZOL加入单个核细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。我以前用此法做过不少标本，结果不错。
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发表于 2015-11-10 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

取血标本后不能马上处理提取总RNA,可以用ficoll分离液将单个核细胞先分离出来，只留细胞沉淀－80度保存，也可以加入二甲亚砜等冻存液低温保存（这种方法比较规范）。
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发表于 2015-11-10 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冻存细胞时要缓慢冷冻，因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间的结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上的蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤的部分，如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。故在细胞冻存时尽可能的均匀减少细胞内水分、减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。
而细胞复苏与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶对细胞造成伤害。
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发表于 2015-11-10 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前做的时候,一般取患者全血8ml,3小时内分离出血清,然后分装至离心管后-20度冰箱内保存.一般来说,每次做RT-PCR只需要50--100ul血清,所以可以根据你的需要决定所需的全血的量.但是,对部分血液科的患者,细胞量较少,可能需要的全血的量要多些.
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hold住[使用道具]
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发表于 2015-11-10 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你用何种方法提取总RNA。千万不能全血冻存，可以在分离出单个核细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。我以前用TRIZOL试剂提取总RNA，此法可将TRIZOL加入单个核细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。我以前用此法做过不少标本，结果不错。
再请教一下：如按hailzhj兄此法做，提取时是不是就不用再加TRIZOl了，直接融化后进行下一步就可以了？

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还有楼上兄谈到冻存细胞时要缓慢冷冻和解冻时快速融化，这对我抽RNA影响大吗？缓慢冷冻和解冻时快速融化具体应如何操作，请详细说明，万分感谢！
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发表于 2015-11-10 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是啊，直接室温裂解就行了，这样对冻存的要求不高，我当时是－20度冻存的，因为不需进行细胞培养，所以对冻存条件要求不高，缓冻速溶是在进行细胞培养时的要求。
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发表于 2015-11-10 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当然会有影响.但具体的我不是很清楚.
我所知道的是,细胞株要放在液氮中冻存,每分钟下降温度1--2度.复苏时直接放到37度水浴中即可.
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